Wydajność czterech testów amplifikacji kwasu nukleinowego w celu identyfikacji SARS-COV-2 w Etiopii

Dziękujemy za odwiedzenie Nature.com. Używasz wersji przeglądarki z ograniczoną obsługą CSS. Aby uzyskać najlepsze wrażenia, zalecamy korzystanie z zaktualizowanej przeglądarki (lub wyłączeniem trybu kompatybilności w Internet Explorer). Ponadto, aby zapewnić ciągłe wsparcie, pokazujemy witrynę bez stylów i JavaScript.
Wyświetla karuzelę trzech slajdów jednocześnie. Użyj poprzednich i następnych przycisków, aby przejść przez trzy slajdy na raz, lub użyj przycisków suwaków na końcu, aby przesuwać się przez trzy slajdy na raz.
Od czasu wybuchu choroby koronawirusa 2019 (COVID-19) na całym świecie opracowano wiele komercyjnych testów amplifikacji kwasu nukleinowego (NAATS) i stały się standardowymi testami. Chociaż kilka testów zostało szybko opracowanych i zastosowanych do laboratoryjnych testów diagnostycznych, wydajność tych testów nie została oceniona w różnych ustawieniach. Dlatego badanie to miało na celu ocenę wydajności testów Abbott SARS-COV-2, Daan, BGI i Sansure Biotech przy użyciu złożonego standardu odniesienia (CRS). Badanie przeprowadzono w Etiopii Public Health Institute (EPHI) w dniach 1 do 30 grudnia 2020 r. 164 Próbki gardła nosogardzieli ekstrahowano przy użyciu zestawu Qiaamp RNA Mini i systemu przygotowania próbki DNA Abbott. Spośród 164 próbek 59,1% było dodatnie, a 40,9% było ujemne dla CR. Pozytywność Sansure Biotech była znacznie niska w porównaniu z CRS (p <0,05). Pozytywność Sansure Biotech była znacznie niska w porównaniu z CRS (p <0,05). Положителье резльтаты Sansure Biotech ыыли значительно но по сравнению с Crs (p <0,05). Pozytywne wyniki Sansure Biotech były znacznie niższe w porównaniu z CRS (p <0,05).与 Crs 相比, Sansure Biotech 的阳性率显着较低 （P <0,05 ）。与 Crs 相比, Sansure Biotech 的阳性率显着较低 （P <0,05 ）。 У Sansure Biotech ыыло значительно менше положительных резльтатов п п пр сравнению с Crs (p <0,05). Sansure Biotech miał znacznie mniej pozytywnych wyników w porównaniu do CR (p <0,05).Ogólna zgoda czterech analiz wyniosła 96,3–100% w porównaniu z CRS. Oprócz niskiego wskaźnika pozytywności testu Sansure Biotech, wydajność czterech testów była prawie porównywalna. W związku z tym test BioTech Sansure [Tylko badania (RUO)] wymaga dodatkowej walidacji do jego zastosowania w Etiopii. Wreszcie należy wziąć pod uwagę dodatkowe badania w celu oceny testów z roszczeniami odpowiedniego producenta.
Testy laboratoryjne są częścią planu strategicznego Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) dla choroby koronawirusa 2019 (COVID-19) gotowości i reakcji (SPRP). Który radzi, aby kraje muszą budować zdolność laboratoryjną w celu poprawy gotowości, właściwego zarządzania sprawami, czujnością i szybką reakcją na wyzwania zdrowia publicznego. Sugeruje to, że rola laboratorium jest kluczem do scharakteryzowania choroby i epidemiologii powstających czynników zakaźnych i kontrolowania ich rozprzestrzeniania się.
Diagnoza Covid-19 wymaga informacji epidemiologicznych i medycznych, objawów/znaków osobistych oraz danych radiograficznych i laboratoryjnych2. Ponieważ wybuch COVID-19 został zgłoszony w Wuhan, Chinach, na całym świecie opracowano wiele komercyjnych testów amplifikacji kwasu nukleinowego (NAAT). Reakcja łańcuchowa polimerazy odwrotnej transkrypcji w czasie rzeczywistym (RRT-PCR) zastosowano jako rutynową i standardową metodę diagnozy laboratoryjnej ciężkiego ostrego zespołu oddechowego 2 (SARS-COV-2) 3. Wykrywanie molekularne SARS-COV-2 jest zwykle oparte na genach N (białko nukleokapsydowe), E (gen białka owocanki) i RDRP (gen genu polimerazy RNA RNA) w ORF1A/B (otwarta rama czytania 1A/B). Region genu) zidentyfikowany na podstawie genomu wirusowego. Są one uważane za główne zachowane regiony występujące w genomach wirusowych dla rozpoznawania wirusa4. Wśród tych genów geny RDRP i E mają wysoką wrażliwość wykrywania analitycznego, podczas gdy gen N ma niską wrażliwość analityczną5.
Wydajność testów PCR może się różnić w zależności od różnych czynników, takich jak: odczynniki ekstrakcyjne, odczynniki amplifikacji/wykrywania, metoda ekstrakcji, jakość maszyny PCR i inne instrumenty. Od kwietnia 2020 r. Ponad 48 różnych urządzeń diagnostycznych z dziewięciu krajów otrzymało zezwolenie na użytek awaryjnego (EUA) dla diagnostyki COVID-196. W Etiopii ponad 14 platform PCR w czasie rzeczywistym jest wykorzystywanych do wykrywania PCR SARS-COV-2 w 26 publicznych instytucjach zdrowia, w tym ABI 7500, Abbott M2000, Roche 48000 i Quant-Studio7. Ponadto dostępne są różne zestawy testowe PCR, takie jak test genowy DAAN, test Abbott SARS-COV-2, test Biotech Sansure i test BGI SARS-COV-2. Chociaż RRT-PCR jest bardzo wrażliwy, niektórzy pacjenci z COVID-19 zgłaszają fałszywie ujemne wyniki z powodu niewystarczających kopii wirusowego kwasu rybonukleinowego (RNA) w próbkach z powodu niewłaściwego zbierania, transportu, przechowywania i obsługi oraz testów laboratoryjnych. Warunki i działania personelu 8. Ponadto ustawienie próbek lub kontroli, ustawienie progu cyklu (CT) i reaktywność krzyżowa z innymi patogennymi kwasami nukleinowymi lub nieaktywnymi/resztkowymi SARS-COV-2 RNA mogą prowadzić do fałszywie dodatnich wyników w testach RRT-PCR9. Jest zatem jasne, że testy PCR mogą rzeczywiście zidentyfikować nośniki fragmentów genów, ponieważ nie mogą nawet rozróżniać naprawdę aktywnych genów wirusowych, więc testy mogą zidentyfikować tylko nośników, a nie pacjentów10. Dlatego ważne jest ocenę wydajności diagnostycznej przy użyciu standardowych metod w naszym otoczeniu. Chociaż wiele odczynników NAAT jest dostępnych w Etiopian Public Health Institute (EPHI) i w całym kraju, nie zgłoszono jeszcze porównawczej oceny ich skuteczności. Dlatego badanie to miało na celu ocenę wydajności porównawczej dostępnych w handlu zestawów do wykrywania SARS-COV-2 przez RRT-PCR przy użyciu próbek klinicznych.
W tym badaniu włączono 164 uczestników z podejrzanym Covid-19. Większość próbek pochodziła z centrów leczenia (118/164 = 72%), podczas gdy pozostałe 46 (28%) uczestników pochodziło z centrów bez leczenia. Wśród uczestników nie leczonych w centrum 15 (9,1%) miało klinicznie podejrzane przypadki, a 31 (18,9%) miało kontakty z potwierdzonymi przypadkami. Dziewięćdziesiąt trzy (56,7%) uczestników to mężczyźni, a średni (± SD) wiek uczestników wynosił 31,10 (± 11,82) lat.
W tym badaniu określono pozytywne i ujemne wskaźniki czterech testów dla Covid-19. Zatem pozytywne wskaźniki testu Abbott SARS-COV-2, test Daan Gene 2019-NCOV, test BGI SARS-COV-2 i test Sansure Biotech 2019-NCOV wynosiły odpowiednio 59,1%, 58,5%, 57,9% i 55,5%. Pozytywne i ujemne wyniki odniesienia złożone (CRS) wyniosły odpowiednio 97 (59,1%) i 67 (40,9%) (Tabela 1). W tym badaniu definicja CRS była oparta na zasadzie „dowolnej pozytywnej”, w której spośród czterech wyników testu dwa lub więcej wyników testów, które dały ten sam wynik, uznano za prawdziwe pozytywne lub negatywne.
W tym badaniu stwierdziliśmy ujemną zgodność procentową (NPA) 100% (95% CI 94,6–100) dla wszystkich analiz w porównaniu z CRS. Analiza Biotechnologii Sansure wykazała minimalną PPA 93,8% (95% CI 87,2-97.1), a analiza Genu Daan 2019-NCOV miała ogólną zgodność 99,4% (95% CI 96,6-99,9). Natomiast ogólna zgoda między testem BGI SARS-COV-2 a testem Sansure Biotech 2019-NCOV wyniosła odpowiednio 98,8% i 96,3% (Tabela 2).
Współczynnik zgodności Cohena między wynikami CRS i Abbott SARS-COV-2 był w pełni spójny (k = 1,00). Podobnie, wartości kappa Cohena wykryte przez Daan Gene 2019-NCOV, SARS-COV-2 BGI i Sansure Biotech 2019-NCOV są również w pełni zgodne z CRS (K ≥ 0,925). W tej analizie porównawczej test Chi-kwadrat (test MCNEMAR) wykazał, że wyniki testu Sansure Biotech 2019-NCOV były znacząco różne od wyników CRS (p = 0,031) (Tabela 2).
Jak pokazano na ryc.1 Procent najniższej wartości CT (<20 ct) testu Abbott SARS-COV-2 (połączony gen RDRP i N) wynosił 87,6%, a wartość CT ORF1A/B wynosił 50,3%, a wartość CT (36–40 ct) wynosiła 3,2%. 1 Procent najniższej wartości CT (<20 ct) testu Abbott SARS-COV-2 (połączony gen RDRP i N) wynosił 87,6%, a wartość CT ORF1A/B wynosił 50,3%, a wartość CT (36–40 ct) wynosiła 3,2%.Jak pokazano na ryc.1, процент наименшего значения (<20 ct) анализа Abbott SARS-COV-2 (комбинио Zrazyons Ct еен RDrp и n) состави samów ORF1A/B анализа Sansure Biotech 2019-NCOV показало что пент низкого значения (<20 ct) сос 40 CT) составлubli 3,2%. 1, odsetek najniższej wartości CT (<20 ct) analizy Abbott SARS-COV-2 (łączonego genu RDRP i N) wynosił 87,6%, a wartość CT genu ORF1A/B (36–40 CT) wykazała, że ​​odsetek niskiej wartości CT (<20 ct) stanowił 50,3%i wysoką wartość (36–40 ct) na rachunku 36%.如图 1 所示, Abbott SARS-COV-2 检测 （结合 RDRP 和 N 基因）的最低 CT 值百分比 （<20 CT ）为 87,6%, Sansure Biotech 2019-NCOV 检测的 ORF1A/B 基因 CT 值显示低 CT 值 (<20 CT) 的百分比为 50,3%， 高 CT 值 (36–40 CT) 的百分比为 3,2%值显示低 CT 值 (<20 CT) Jak pokazano na rycinie 1, najniższy procent wartości CT (<20 ct) testu Abbott SARS-COV-2 (kombinacja genu RDRP i N) wynosi 87,6%, procent genu ORF1A/B 值 值 值 值 值 值 值 值 值 值 值 值 值 值 值 值 值 36–40 ct) 的 procent IS IS IS IS IS IS IS IS IS IS IS IS IS IS IS IS IS IS IS IS IS IS IS IS IS 3,2%. Как показано на рисунке 1, анализ Abbott Sars-Cov-2 (сочетающий гены rdrp и n) имел саме низкое ligenia пначениniej разере 87,6%, аначение ct гена orf1a/b в иссле więc Jak pokazano na rycinie 1, test Abbott SARS-COV-2 (łączenie genów RDRP i N) miał najniższą wartość CT (<20 ct) przy 87,6%, podczas gdy wartość CT genu ORF1A/B w badaniu Sansure Biotech 2019-analiza NCOV wykazała niskie CT. Процент значений (<20 ct) составил 50,3%, а процент ыыих значений CT (36–40 ct) сосавил 3,2%. Odsetek wartości (<20 ct) wynosił 50,3%, a odsetek wysokich wartości CT (36–40 ct) wynosił 3,2%.Test Abbott SARS-COV-2 B zarejestrował wartości CT powyżej 30. Z drugiej strony, w teście BGI SARS-COV-2 gen ORF1A/B miał wysoką wartość CT (> 36 ct) procent wynosił 4% (ryc. 1). Z drugiej strony, w teście BGI SARS-COV-2 gen ORF1A/B miał wysoką wartość CT (> 36 ct) procent wynosił 4% (ryc. 1). Сруой стороны, в анализе BGI SARS-COV-2 ген ORF1A/B имел ысокое значение CT (> 36 ct), п п п п Z drugiej strony w analizie genu BGI SARS-COV-2 ORF1A/B miał wysoką wartość CT (> 36 ct), którego procent wynosił 4% (ryc. 1).另一方面 在 BGI SARS-COV-2 检测中, ORF1A/B 基因具有高 CT 值 （> 36 CT ）的百分比为 4%（图 1 ）。 Z drugiej strony, w wykrywaniu BGI SARS-COV-2, odsetek genu ORF1A/B o wysokiej wartości CT (> 36 ct) wynosi 4% (ryc. 1). Сруой стороны, в анализfe BGI SARS-COV-2 RYрцент генов Orf1a/B с ыысокими значениulaми Ct (> 36 ct) составиlars 4% (р рис. 1). Z drugiej strony, w analizie BGI SARS-COV-2, odsetek genów ORF1A/B o wysokich wartościach CT (> 36 ct) wynosił 4% (ryc. 1).
W tym badaniu wzięliśmy 164 próbki nosogardzieli. Dla wszystkich rodzajów testów izolację i amplifikację RNA przeprowadzono przy użyciu metod i zestawów zalecanych przez odpowiednich producentów.
Badanie to wykazało, że test Abbotta dla SARS-COV-2 ma taką samą wydajność wykrywalności jak CRS, ze 100% pozytywną, negatywną i ogólną zgodnością. Umowa Kappa Cohena wynosi 1,00, co wskazuje na pełną zgodność z CRS. Podobne badanie przeprowadzone przez University of Washington w USA wykazało, że ogólna wrażliwość i swoistość testu Abbott dla SARS-COV-2 wyniosła odpowiednio 93% i 100%, w porównaniu z testem laboratoryjnym (LDA) CDC. 11. System wykrywania Abbott SARS-COV-2 oparty jest na jednoczesnym połączonym wykryciu genów N i RDRP, ponieważ oba geny są bardziej wrażliwe, minimalizując fałszywe negatywy12. Badanie w Wiedniu w Austrii wykazało również, że duże objętości próbki ekstrakcji i objętości eluentu wykrywania zminimalizowały efekty rozcieńczenia i zwiększoną wydajność wykrywania13. Zatem idealne dopasowanie Abbotta do testu SARS-COV-2 może być powiązane z systemem wykrywania platformy, który jednocześnie wykrywa geny kombinatoryczne, wydobywa dużą liczbę próbek (0,5 ml) i wykorzystuje dużą ilość eluent (40 µl).
Nasze wyniki wykazały również, że wydajność wykrywania testu genetycznego Daan była prawie taka sama jak w przypadku CRS. Jest to zgodne z badaniem14 przeprowadzonym na Uniwersytecie Anhui w Huainan w Chinach oraz roszczeniem producenta o 100% pozytywnej zgody. Pomimo doniesień o spójnych wynikach, jedna próbka była fałszywie negatywna po ponownym przetestowaniu tego samego eluatu, ale była pozytywna w testach Abbott SARS-COV-2 i Sansure Biotech NCOV-2019. Sugeruje to, że może istnieć zmienność wyników w różnych rodzajach testów. Niemniej jednak w badaniu przeprowadzonym w Chinach15 wynik testu genu DAAN był znacząco inny (p <0,05) w porównaniu z ich testem referencyjnym zdefiniowanym przez laboratorium. Niemniej jednak w badaniu przeprowadzonym w Chinach15 wynik testu genu DAAN był znacząco inny (p <0,05) w porównaniu z ich testem referencyjnym zdefiniowanym przez laboratorium. Тем ненеra, в иссле więc gen значите15, р Mójз зльтатsenu аализаз daan gen значительно о о о 0,05) аноих лабораторногогогогогононого анализа. Jednak w badaniu z Chin15 wynik analizy genu Daana był znacząco różny (p <0,05) od ich laboratoryjnej analizy referencyjnej.然而 在中国进行的研究中 15 ， 大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差异 p <0,05 ）。然而 在中国进行的研究中 15 ， 大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差 <0,05 Однако и исследовании złoty, lig W WIEKA прRYне в китаniej сраванию с эталонны лабораторны тестом. Jednak w badaniu z Chin15 wyniki testu genetycznego Daana były znacząco różne (p <0,05) w porównaniu z referencyjnym testem laboratoryjnym.Ta rozbieżność może wynikać z czułości testu odniesienia w celu wykrycia SARS-COV-2, a dalsze badania mogą być ważne dla ustalenia przyczyny.
Ponadto w naszym badaniu oceniono wydajność porównawczą testu BGI SARS-COV-2 z CRS, wykazując doskonałą pozytywną zgodność procentową (PPA = 97,9%), ujemną zgodność procentową (NPA = 100%) oraz ogólną zgodność procentową według płci (OPA). ). = 98,8%). Wartości kappa Cohena wykazały dobrą zgodność (k = 0,975). Badania w Holandii16 i Chin15 wykazały spójne wyniki. Test BGI SARS-COV-2 to test wykrywania pojedynczego genu (ORF1A/B) przy użyciu eluatu amplifikacji/wykrywania 10 µl. Pomimo dobrego porozumienia statystycznego z naszymi wynikami referencyjnymi, analiza straciła dwie dodatnie próbki (1,22%) całkowitej próbki. Może to mieć ogromne implikacje kliniczne dla dynamiki transmisji zarówno na poziomie pacjenta, jak i społeczności.
Inną analizą porównawczą zawartą w tym badaniu był test Sansure Biotech NCOV-2019 RRT-PCR (RUO); Ogólny procent meczu wyniósł 96,3%. Siła porozumienia została również określona przez wartość kappa Cohena, która wynosiła 0,925, co wskazuje na pełną zgodność z CRS. Ponownie, nasze wyniki są identyczne z badaniami przeprowadzonymi na Central South University w Changsha w Chinach oraz w Departamencie Laboratorium Laboratorium Clinical w Liuzhou, Liuzhou City, Chiny17. Mimo że odnotowano powyższą dobrą zgodność statystyczną, test chi-kwadrat (test MacNemar) wykazał, że wynik testu BioTech Sansure miał statystycznie istotną różnicę w porównaniu z CRS (p <0,005). Mimo że odnotowano powyższą dobrą zgodność statystyczną, test chi-kwadrat (test MacNemar) wykazał, że wynik testu BioTech Sansure miał statystycznie istotną różnicę w porównaniu z CRS (p <0,005). Несмотря на то, что ыафафиксировано указазазное ышыш хороше сатистическое сответa złósł (критерий макнемара) показал, что резльтат анализа Sansure Biotech имет сатисokój 0,005). Chociaż odnotowano dobrą umowę statystyczną, test chi-kwadrat (test MCNEMAR) wykazał, że wynik testu Biotech Sansure miał statystycznie istotną różnicę w porównaniu z CRS (p <0,005).尽管记录了上述良好的统计一致性 但卡方检验 （MacNemar 检验）表明, Sansure Biotech 检测的结果与 Crs 相比具有统计学显着差异 （P <0,005 ）。尽管 记录 了 上述 良好 统计 一致性 但 但 （（MacNemar 检验 表明, Sansure Biotech 检测 结果 与 Crs 相比 显着 （（P <0,005 。。。。。。。。。。。。。。。。。。。）））） Несмотря на отмеченное ыше хороше статистисеское сответствие, критерий хи -czej статистически значимю разниц (p <0,005) между анализом Sansure Biotech и Crs. Pomimo dobrej porozumienia statystycznego, test Chi-kwadrat (test MCNEMAR) wykazał statystycznie istotną różnicę (p <0,005) między testem BioTech Sansure a CRS.Stwierdzono, że sześć próbek (3,66%) stanowi fałszywe negatywy w porównaniu do CR (tabela uzupełniająca 1); Jest to bardzo ważne, zwłaszcza biorąc pod uwagę dynamikę przenoszenia wirusa. Powyższe dane potwierdzają również ten niski wskaźnik wykrywania15.
W tym badaniu wartości CT określono dla każdego testu i odpowiedniej platformy, przy najniższej średniej wartości CT zgłoszonej w teście Abbott SARS-COV-2. Wynik ten może być związany z jednoczesnym połączonym systemem badań genetycznych Abbott do wykrywania SARS-COV-2. Dlatego, zgodnie z ryc. 1, 87,6% wyników Abbott SARS-COV-2 miało wartości CT poniżej 20. Tylko niewielka liczba wyników próbki (12,4%) była w zakresie 20-30. Wartości CT powyżej 30 nie zostały zarejestrowane. Oprócz zastosowania formatu testowania genetycznego panelu SARS-COV-2 przez Abbott, wynik ten może być powiązany z niższym limitem wykrywalności (32,5 kopii RNA/ml) 18, który jest trzy razy niższy niż dolna granica 100 kopii RNA/ml. ML) 19.
To badanie ma pewne ograniczenia: po pierwsze, nie mamy metod standardowych/odniesienia [takich jak obciążenie wirusowe lub inne testy laboratoryjne (LDA)] z powodu braku zasobów. Po drugie, wszystkie próbki zastosowane w tym badaniu były wymazami nosogardzieli, podczas gdy wyniki nie miały zastosowania do innych rodzajów próbek, a po trzecie, nasza wielkość próbki była niewielka.
W tym badaniu porównano wydajność czterech testów RRT-PCR dla SARS-COV-2 przy użyciu próbek nosogardzieli. Wszystkie testy wykrywania miały prawie porównywalną wydajność, z wyjątkiem testu BioTech Sansure. Poza tym niska szybkość pozytywności zidentyfikowano w teście BioTech Sansure w porównaniu z CRS (p <0,05). Poza tym niska szybkość pozytywności zidentyfikowano w teście BioTech Sansure w porównaniu z CRS (p <0,05). Кроме того, весте Sansure Biotech ыыл ыявлен низ пр samowie Ponadto test biotechnologiczny Bransure wykazał niski odsetek pozytywnych wyników w porównaniu z CR (p <0,05).此外 与 Crs 相比, Sansure Biotech 检测的阳性率较低 (p <0,05)。此外 与 Crs 相比, Sansure Biotech 检测的阳性率较低 (p <0,05)。 Кроме того, анализ sansure biotech имел более низкий уровень положительных резльтlacji Ponadto test biotechnologiczny Sansure miał niższy wskaźnik pozytywności w porównaniu z CR (p <0,05).Analiza Sansure Biotech NCOV-2019 (RUO) PPA, NPA i ogólna zgodność przekroczyła 93,5% z siłą Cohena Kappa wartości zgodności 0,925. Wreszcie, test Sansure Biotech (RUO) wymaga dalszej walidacji do stosowania w Etiopii, a dodatkowe badania należy wziąć pod uwagę w celu oceny roszczeń poszczególnych producentów.
Projekt badań porównawczych przeprowadzono w czterech placówkach służby zdrowia w Addis Abeba, szpitalu Eka Kotebe, Millennium Church Treatment Center, Zewooditu Memorial Hospital i specjalistycznym szpitalu św. Piotra. Dane zostały zebrane między 1 a 31 grudnia 2020 r. Urządzenia medyczne w tym badaniu zostały celowo wybrane na podstawie ich dużej liczby przypadków i dostępności głównych centrów leczenia w mieście. Podobnie instrumenty, w tym instrumenty PCR w czasie rzeczywistym ABI 7500 i Abbott M2000, zostały wybrane zgodnie z zaleceniami producentów odczynnika NAAT, a do tego badania wybrano cztery zestawy wykrywania PCR, ponieważ większość laboratoriów w Etiopii wykorzystywała co najmniej cztery z nich. Test genowy, test Abbott SARS-COV-2, test biotechnologiczny Sansure i test BGI SARS-COV-2 przeprowadzony podczas badania).
Testy dla SARS-COV-2 przeprowadzono od 1 do 30 grudnia 2020 r., Przy użyciu 3 ml wirusowego pożywki transportowej (VTM) (technologia miraclean, Shenzhen, Chiny) od osób badanych dla Covid-19, odniesionych do EPHI. Próbki nosogardzieli pobrano przez przeszkolonych próbek i wysłano do EPHI w potrójnych paczkach. Przed izolacją kwasu nukleinowego każdą próbkę przypisuje się unikalny numer identyfikacyjny. Ekstrakcja jest wykonywana z każdej próbki natychmiast po przyjeździe przy użyciu metod ręcznych i automatycznych ekstrakcji. Zatem dla automatycznej ekstrakcji Abbott M2000, 1,3 ml (w tym 0,8 ml objętości martwej i objętości ekstrakcji 0,5 ml) próbki wyodrębniono z każdej próbki i przepuszczono przez system przygotowania próbki Abbott DNA (Abbott Molecular Inc. des Plaines, IL, USA). ) Partia 96 [92 próbek, dwie kontrole wykrywania i dwie kontrole nie-twórców (NTC)] zostały uwzględnione w ogólnym procesie (pobieranie i wykrycie) dwóch rund SARS-COV-2 (EUA) w czasie rzeczywistym. górnictwo. Podobnie do ręcznego ekstrakcji użyj tych samych próbek (do automatycznego ekstrakcji i odkrywania). Zatem przez cały proces 140 µl próbek poddano porodzie i ekstrahowano za pomocą wirusowego zestawu RNA Qiaamp (Qiagen GmbH, Hilden, Niemcy) w partiach 24 (w tym 20 próbek, dwóch kontrolach testowych i dwóch NTC) w dziewięciu pociskach. Ręcznie wyodrębnione eluaty wzmocniono i wykryto za pomocą cyklownika termicznego ABI 7500 przy użyciu testu SARS-COV-2 BGI, testu genu DAAN i testu Sansure Biotech.
Zautomatyzowana izolacja i oczyszczanie wirusowego RNA SARS-COV-2 jest zgodne z zasadą kulki magnetycznej przy użyciu odczynników przygotowania próbki Abbott DNA. Inaktywację próbek i rozpuszczenie cząstek wirusowych przeprowadza się przy użyciu detergentu zawierającego izotiocyjanian guanidyny w celu denatury białka i inaktywowanej RNazy. RNA jest następnie oddzielane od białka przez separacja fazy stałej za pomocą krzemionki, tj. Sól guanidyniowa i alkalicznego pH buforu do lizy sprzyjają wiązaniu kwasów nukleinowych z krzemionką (SiO2). Krok płukania usuwa pozostałe białka i zanieczyszczenia w celu uzyskania wyraźnego roztworu. Przezroczysty RNA jest izolowany z mikrocząstek na bazie krzemionki przy użyciu pola magnetycznego 20,21. Z drugiej strony ręczna izolacja i oczyszczanie RNA jest przeprowadzana metodą kolumny spinowej przy użyciu wirowania zamiast stojaka magnetycznego i oddzielenia mikrocząstek od eluentu.
Test wykrywania SARS-COV-2 w czasie rzeczywistym w czasie rzeczywistym (Abbott Molecular, Inc.) został przeprowadzony zgodnie z instrukcjami producenta, który otrzymał EUA19 22 od WHO i FDA. W tym protokole inaktywację próbki przed ekstrakcją przeprowadzono w kąpieli wodnej w 56 ° C przez 30 minut. Po inaktywacji wirusa ekstrakcję kwasu nukleinowego przeprowadzono na instrumencie Abbott M2000 SP od 0,5 ml VTM przy użyciu systemu przygotowania próbki DNA Abbott M2000. Według producenta. Amplifikację i wykrywanie przeprowadzono przy użyciu instrumentu Abbott M2000 RT-PCR, a podwójne wykrywanie przeprowadzono dla genów RDRP i N. ROX) i VIC P (zastrzeżony barwnik) do celowania i wykrywania kontroli wewnętrznych, umożliwiając jednoczesne wykrywanie obu produktów amplifikacji 19.
Metoda wykrywania amplifikacji tego zestawu oparta jest na jednoetapowej technologii RT-PCR. Geny ORF1A/B i N wybrano jako regiony konserwowane przez technologię genów DAAN w celu wykrycia amplifikacji regionu docelowego. Specyficzne startery i sondy fluorescencyjne (N sondy genowe znakowane FAM, sondy ORF1A/B znakowane VIC) zostały zaprojektowane do wykrywania RNA SARS-COV-2 w próbkach. Ostateczne mieszanki eluent i główne przygotowano przez dodanie 5 µl eluent do 20 µl mieszanki głównej do końcowej objętości 25 µl. Amplifikację i wykrywanie przeprowadzono jednocześnie na instrumencie PCR w czasie rzeczywistym ABI 750024.
Geny ORF1A/B i N wykryto przy użyciu zestawu diagnostycznego kwasu nukleinowego Sansure Biotech NCOV-2019 (wykrywanie fluorescencyjne PCR). Przygotuj określone sondy dla każdego genu docelowego, wybierając kanał FAM dla regionu ORF1A/B i kanału ROX dla genu N. Do tego zestawu testowego odczynniki Eluent i Master Mix są dodawane w następujący sposób: Przygotuj 30 µl Master Mix Reagent i 20 µl próbki eluowanej do wykrywania/amplifikacji. Do amplifikacji/wykrywania zastosowano PCR w czasie rzeczywistym PCR ABI 750025.
Test BGI SARS-COV-2 to fluorescencyjny zestaw RRT-PCR w czasie rzeczywistym do diagnozy COVID-19. Region docelowy znajduje się w regionie ORF1A/B genomu SARS-COV-2, który jest metodą detekcji pojedynczej genu. Ponadto gen β-aktyny ludzki β-aktyna jest wewnętrznie regulowanym genem docelowym. Master mieszanka przygotowuje się przez zmieszanie 20 µl odczynnika mieszanki głównej i 10 µl ekstrahowanej próbki RNA w studzience 26. Do amplifikacji zastosowano fluorescencyjny instrument PCR w czasie rzeczywistym ABI 7500. Wszystkie wzmocnienie kwasu nukleinowego, warunki biegania PCR dla każdego testu i interpretację wyników przeprowadzono zgodnie z instrukcjami odpowiedniego producenta (Tabela 3).
W niniejszej analizie porównawczej nie zastosowaliśmy standardowej metody odniesienia do ustalenia procentowej zgodności (dodatnia, ujemna i ogólnie) i innych parametrów porównawczych dla czterech analiz. Każde porównanie testu przeprowadzono z CRS, w tym badaniu CRS ustalono na podstawie reguły „dowolnej pozytywnej”, a wynik określono, a nie za pomocą jednego testu, zastosowaliśmy co najmniej dwa dopasowane wyniki testu. Ponadto, w przypadku transmisji COVID-19, wyniki fałszywie negatywnych są bardziej niebezpieczne niż wyniki fałszywie dodatnie. Dlatego, mówiąc „pozytywne” tak dokładnie, jak to możliwe, z wyniku CRS, co najmniej dwa testy testowe muszą być pozytywne, co oznacza, że ​​co najmniej jeden wynik pozytywny prawdopodobnie pochodzi z testu UEA. Zatem spośród czterech wyników testu, dwa lub więcej wyników testów, które dają ten sam wynik, są uważane za prawdziwe pozytywne lub negatywne 18,27.
Dane zebrano przy użyciu strukturalnych formularzy ekstrakcji danych, wprowadzanie danych i analiza przeprowadzono przy użyciu oprogramowania statystycznego Excel i SPSS w wersji 23.0 dla statystyki opisowej. Przeanalizowano pozytywną, negatywną i ogólną zgodność zgodną, ​​a wynik kappa zastosowano do ustalenia stopnia zgodności każdej metody z CRS. Wartości Kappa są interpretowane w następujący sposób: 0,01 do 0,20 dla łagodnej umowy, 0,21 do 0,40 dla ogólnej zgody, 0,41-0,60 dla umiarkowanej umowy, 0,61-0,80 dla głównej umowy i 0,81-0,99 dla pełnej umowy 28.
Zezwolenie etyczne uzyskano z University of Addis Abeba, a wszystkie protokoły eksperymentalne dla tego badania zostały zatwierdzone przez Etiopian Public Health Institute Scientific Ethics Review. Numer referencyjny licencji etyki EPHI to EPHI/IRB-279-2020. Wszystkie metody zastosowano zgodnie z zaleceniami i przepisami krajowych kompleksowych wytycznych Etiopii dotyczących leczenia Covid-19. Ponadto od wszystkich uczestników badania uzyskano pisemną świadomą zgodę przed udziałem w badaniu.
Wszystkie dane uzyskane lub przeanalizowane w tym badaniu są zawarte w tym opublikowanym artykule. Dane potwierdzające wyniki tego badania są dostępne od odpowiedniego autora na rozsądne żądanie.
Światowa Organizacja Zdrowia. Zalecenia dotyczące strategii testowania laboratoryjnego dla Covid-19: Poradnik tymczasowy, 21 marca 2020 nr WHO/2019-NCOV/LAB_TESTING/2020.1 (WHO, 2020).
Mouliou, DS, Pantazopoulos, I. i Gourgoulianis, KI Covid-19 Mądra diagnoza na oddziale ratunkowym: all-in w praktyce. Mouliou, DS, Pantazopoulos, I. i Gourgoulianis, KI Covid-19 Mądra diagnoza na oddziale ratunkowym: all-in w praktyce.Muliou, DS, Pantazopoulos, I. i Gurgulianis, KI Inteligentna diagnoza Covid-19 na oddziale ratunkowym: wszystko w praktyce.Muliou DS, Pantazopoulos I. i Gurgulyanis Ki Inteligentna diagnoza Covid-19 na oddziałach ratunkowych: integracja z kompleksem do końca w praktyce. Expert Reverend Respire. medycyna. 3, 263–272 (2022).
Mitchell, SL & St George, K. Ocena COVID19 ID NOW EUA. Mitchell, SL & St George, K. Ocena COVID19 ID NOW EUA.Mitchell, SL i St. George, K. Ocena COVID19 ID NOW EUA.Mitchell SL i St. George K. Ocena COVID19 ID NOW EUA. J. kliniczne. Wirus. 128, 104429. Https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104429 (2020).
KTO. Laboratoryjne wykrywanie choroby koronawirusa 2019 (COVID-19) w podejrzewanej chorobie człowieka. https://www.who.int/publications/i/item/10665-331501 (dostęp 15 sierpnia 2020 r.) (WHO, 2020).
Udugama, B. i in. Diagnoza COVID-19: choroby i narzędzia testowe. ACS Nano 14 (4), 3822–3835 (2020).
Syed S. i in. Ustanowienie College of Patologists of Eastern, środkowej i południowej Afryki - Regionalna Szkoła Patologii Bliskiego Wschodu i Afryki Południowej. Afryka. J. Lab. medycyna. 9 (1), 1-8 (2020).
Etiopski Instytut Zdrowia Publicznego, Federalne Ministerstwo Zdrowia. Tymczasowa krajowa strategia i wskazówki dotyczące diagnozy laboratoryjnej Covid-19. https://ephi.gov.et/images/novel_coronavirus/ephi_pheoc_covid-19_laboratory_diagnosis_eng.pdf (dostęp 12 sierpnia 2020 r.) (Ephi, 2020).
Woloshin, S., Patel, N. i Kesselheim, jako fałszywie negatywne testy na wyzwania i implikacje infekcji SARS-COV-2. Woloshin, S., Patel, N. i Kesselheim, jako fałszywie negatywne testy na wyzwania i implikacje infekcji SARS-COV-2.Voloshin S., Patel N. i Kesselheim jako fałszywie ujemne testy zakażeń SARS-COV-2 i ich konsekwencji.Voloshin S., Patel N. i Kesselheim jako fałszywie ujemne testy prowokacji i wpływ infekcji SARS-COV-2. N. Eng. J. Medicine. 383 (6), E38 (2020).
Mouliou, DS i Gourgoulianis, KI fałszywie dodatni i fałszywie ujemne przypadki Covid-19: strategie zapobiegania oddechom i zarządzaniu, szczepienie i dalsze perspektywy. Mouliou, DS i Gourgoulianis, KI fałszywie dodatni i fałszywie ujemne przypadki Covid-19: strategie zapobiegania oddechom i zarządzaniu, szczepienie i dalsze perspektywy. Mouliou, ds & gourgoulianis, ki лжнокоrayжите służby и ижнотрицательные слччаи ovvid-19: респиubli, вакцинация и дальнейшие перспективы. Mouliou, DS i Gourgoulianis, KI fałszywie pozytywne i fałszywie negatywne przypadki Covid-19: strategie zapobiegania oddechom i leczeniu, szczepienia i droga naprzód.MULIU, DS i GURGULIANIS, KI fałszywie dodatnie i fałszywie ujemne przypadki COVID-19: Strategie zapobiegania i leczenia oddechowym, szczepienia i przyszłości. Expert Reverend Respire. medycyna. 15 (8), 993–1002 (2021).
Mouliou, DS, Ioannis, P. i Konstantinos, G. Covid-19 Diagnoza na oddziale ratunkowym: widzenie drzewa, ale utrata lasu. Mouliou, DS, Ioannis, P. i Konstantinos, G. Covid-19 Diagnoza na oddziale ratunkowym: widzenie drzewa, ale utrata lasu.Mouliou, DS, Ioannis, P. i Konstantinos, G. Covid-19 Diagnoza na oddziale ratunkowym: Zobacz drzewo, Zagub las.Muliou DS, Ioannis P. i Konstantinos G. Covid-19 Diagnoza na pogotowie: za mało lasu dla drzew. Pojawić się. medycyna. J. https://doi.org/10.1136/emermed-2021-212219 (2022).
DeGli-Angeli, E. i in. Walidacja i walidacja wydajności analitycznej i klinicznej testu Abbott Realtime SARS-COV-2. J. kliniczne. Wirus. 129, 104474. Https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104474 (2020).
Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Porównanie pięciu zestawów starterów z różnych regionów genomu Covid-19 w celu wykrycia zakażenia wirusem przez konwencjonalne RT-PCR. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Porównanie pięciu zestawów starterów z różnych regionów genomu COVID-19 w celu wykrycia infekcji wirusowej przez konwencjonalne RT-PCR.Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neestanaki, D., Fazlalipour, M. i Aflatunyan, B. Porównanie pięciu zestawów starterów z różnych regionów genomu CovID-19 do wykrywania infekcji wirusowej przez konwencjonalne RT-PCR. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. 比较来自 Covid-19 不同基因组区域的五个引物组 用于通过常规 RT-PCR 检测病毒感染。 Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Porównanie 5 różnych regionów genetycznych Covid-19 w celu wykrycia infekcji wirusowej przez konwencjonalne RT-PCR.Mollaei HR, Afshar AA, Kalantar-Neestanaki D, Fazlalipour M. i Aflatunyan B. Porównanie pięciu zestawów starterów z różnych regionów genomu Covid-19 do wykrywania infekcji wirusowej przez konwencjonalną RT-PCR.Iran. J. Microbiology. 12 (3), 185 (2020).
GOERTZER, I. i in. Wstępne wyniki krajowego zewnętrznego programu oceny jakości do wykrywania sekwencji genomu SARS-COV-2. J. kliniczne. Wirus. 129, 104537. Https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104537 (2020).
Wang, M. i in. Analityczna ocena skuteczności pięciu zestawów RT-PCR dla ciężkiego ostrego zespołu oddechowego Coronawirusa 2. J. Kliniczne. laboratorium. odbyt. 35 (1), E23643 (2021).
Wang B. i in. Ocena siedmiu dostępnych w handlu zestawów wykrywania RNA SARS-COV-2 w Chinach w oparciu o reakcję łańcuchową polimerazy w czasie rzeczywistym (PCR). kliniczny. Chemiczny. laboratorium. medycyna. 58 (9), E149 - E153 (2020).
Van Casteren, PB i in. Porównanie siedmiu komercyjnych zestawów diagnostycznych RT-PCR COVID-19. J. kliniczne. Wirus. 128, 104412 (2020).
Lu, Yu i in. Porównanie wydajności diagnostycznej dwóch zestawów PCR do wykrywania kwasów nukleinowych SARS-COV-2. J. kliniczne. laboratorium. odbyt. 34 (10), E23554 (2020).
Lefart, PR itp. Badanie porównawcze czterech platform amplifikacji kwasu nukleinowego SARS-COV-2 (NAAT) wykazało, że wydajność ID była znacznie zdegradowana w zależności od rodzaju pacjenta i próbki. diagnoza. mikrobiologia. Infekować. diss. 99 (1), 115200 (2021).
Cząsteczka Abbott. Abbott wstawka analizy SARS-COV-2 w czasie rzeczywistym. https://www.molecular.abbott/us/en/products/infectious-disease/realtime-sars-cov-2-assay. 1-12. (Od 10 sierpnia 2020 r.) (2020).
Klein, S. i in. Izolacja RNA SARS-COV-2 za pomocą magnetycznych perełek do szybkiego wykrywania na dużą skalę przez RT-QPCR i RT-lamp. Wirus 12 (8), 863 (2020).