Wykonanie czterech testów amplifikacji kwasów nukleinowych w celu identyfikacji SARS-CoV-2 w Etiopii

Dziękujemy za odwiedzenie Nature.com. Używasz wersji przeglądarki z ograniczoną obsługą CSS. Aby uzyskać najlepszą jakość, zalecamy użycie zaktualizowanej przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w przeglądarce Internet Explorer). Dodatkowo, aby zapewnić bieżące wsparcie, pokazujemy witrynę bez stylów i JavaScript.
Wyświetla karuzelę z trzema slajdami jednocześnie. Użyj przycisków Poprzedni i Następny, aby przejść przez trzy slajdy jednocześnie, lub użyj przycisków suwaka na końcu, aby przejść przez trzy slajdy jednocześnie.
Od czasu wybuchu choroby koronawirusowej (COVID-19) w 2019 r. na całym świecie opracowano wiele komercyjnych testów amplifikacji kwasów nukleinowych (NAAT), które stały się standardowymi testami. Chociaż szybko opracowano kilka testów i zastosowano je w laboratoryjnych testach diagnostycznych, skuteczność tych testów nie została oceniona w różnych warunkach. Dlatego też niniejsze badanie miało na celu ocenę skuteczności testów Abbott SARS-CoV-2, Daan Gene, BGI i Sansure Biotech przy użyciu złożonego standardu referencyjnego (CRS). Badanie przeprowadzono w Etiopskim Instytucie Zdrowia Publicznego (EPHI) w dniach 1–30 grudnia 2020 r. Pobrano 164 próbki z jamy nosowo-gardłowej przy użyciu mini zestawu QIAamp RNA i systemu przygotowania próbek DNA firmy Abbott. Spośród 164 próbek 59,1% dało wynik pozytywny, a 40,9% negatywny pod względem CRS. Wynik pozytywny Sansure Biotech był znacząco niski w porównaniu z CRS (p < 0,05). Wynik pozytywny Sansure Biotech był znacząco niski w porównaniu z CRS (p < 0,05). Положительные результаты Sansure Biotech jest niezależny od CRS (p < 0,05). Pozytywne wyniki Sansure Biotech były istotnie niższe w porównaniu do CRS (p < 0,05).CRS 相比, Sansure Biotech 的阳性率显着较低(p < 0,05).CRS 相比, Sansure Biotech 的阳性率显着较低(p < 0,05). Sansure Biotech wydało pozytywną opinię na temat CRS (p < 0,05). Sansure Biotech uzyskało znacznie mniej pozytywnych wyników w porównaniu do CRS (p < 0,05).Ogólna zgodność czterech analiz wyniosła 96,3–100% w porównaniu z CRS. Oprócz niskiego wskaźnika dodatniości testu Sansure Biotech, wydajność czterech testów była prawie porównywalna. W związku z tym test Sansure Biotech [tylko do celów badawczych (RUO)] wymaga dodatkowej walidacji pod kątem jego stosowania w Etiopii. Wreszcie, należy rozważyć dodatkowe badania w celu oceny testów z odpowiednimi oświadczeniami producenta.
Badania laboratoryjne są częścią Planu strategicznego Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) dotyczącego gotowości i reagowania na chorobę koronawirusową 2019 (COVID-19) (SPRP). WHO zaleca, aby kraje zbudowały potencjał laboratoryjny w celu poprawy gotowości, właściwego zarządzania przypadkami, czujności i szybkiego reagowania na wyzwania związane ze zdrowiem publicznym. Sugeruje to, że rola laboratorium jest kluczowa w charakteryzowaniu choroby i epidemiologii pojawiających się czynników zakaźnych oraz kontrolowaniu ich rozprzestrzeniania się.
Rozpoznanie COVID-19 wymaga informacji epidemiologicznych i medycznych, objawów osobistych oraz danych radiograficznych i laboratoryjnych2. Od czasu wybuchu epidemii Covid-19 w Wuhan w Chinach na całym świecie opracowano wiele komercyjnych testów amplifikacji kwasów nukleinowych (NAAT). Reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym (rRT-PCR) jest rutynową i standardową metodą diagnostyki laboratoryjnej zakażenia ciężkim ostrym zespołem oddechowym 2 (SARS-CoV-2)3. Molekularne wykrywanie SARS-CoV-2 zazwyczaj opiera się na genach N (gen białka nukleokapsydu), E (gen białka otoczki) i RdRp (gen polimerazy RNA zależnej od RNA) w ORF1a/b (otwarta ramka odczytu 1a/b) . gen) region zidentyfikowany z genomu wirusa. Uważa się, że są to główne konserwatywne regiony występujące w genomach wirusowych na potrzeby rozpoznawania wirusów4. Wśród tych genów geny RdRp i E mają wysoką czułość wykrywania analitycznego, podczas gdy gen N ma niską czułość analityczną5.
Wydajność testów PCR może się różnić w zależności od różnych czynników, takich jak: odczynniki do ekstrakcji, odczynniki do amplifikacji/detekcji, metoda ekstrakcji, jakość maszyny do PCR i innych instrumentów. Według stanu na kwiecień 2020 r. ponad 48 różnych urządzeń diagnostycznych z dziewięciu krajów otrzymało zezwolenie na użycie w sytuacjach awaryjnych (EUA) do diagnostyki COVID-196. W Etiopii do wykrywania metodą PCR SARS-CoV-2 w 26 instytucjach zdrowia publicznego wykorzystuje się ponad 14 platform PCR w czasie rzeczywistym, w tym ABI 7500, Abbott m2000, Roche 48000 i Quant-studio7. Ponadto dostępne są różne zestawy testów PCR, takie jak test Daan Gene, test Abbott SARS-CoV-2, test Sansure Biotech i test BGI SARS-CoV-2. Chociaż rRT-PCR jest bardzo czuły, niektórzy pacjenci z COVID-19 zgłaszają fałszywie ujemne wyniki z powodu niewystarczającej liczby kopii wirusowego kwasu rybonukleinowego (RNA) w próbkach z powodu niewłaściwego pobierania, transportu, przechowywania i obchodzenia się z nim oraz badań laboratoryjnych. warunki i działania personelu8. Ponadto nieprawidłowe obchodzenie się z próbką lub kontrolą, ustawienie progu cyklu (Ct) i reaktywność krzyżowa z innymi patogennymi kwasami nukleinowymi lub nieaktywnym/resztkowym RNA SARS-CoV-2 mogą prowadzić do fałszywie dodatnich wyników w testach rRT-PCR9. Zatem jasne jest, że testy PCR rzeczywiście mogą zidentyfikować nosicieli fragmentów genów, ponieważ nie są w stanie nawet rozróżnić naprawdę aktywnych genów wirusa, zatem testy mogą zidentyfikować jedynie nosicieli, a nie pacjentów10. Dlatego ważna jest ocena wyników diagnostycznych przy użyciu standardowych metod w naszym środowisku. Chociaż wiele odczynników NAAT jest dostępnych w Etiopskim Instytucie Zdrowia Publicznego (EPHI) i w całym kraju, nie zgłoszono jeszcze żadnej porównawczej oceny ich skuteczności. Dlatego też niniejsze badanie miało na celu ocenę porównawczą skuteczności dostępnych na rynku zestawów do wykrywania SARS-CoV-2 metodą rRT-PCR przy użyciu próbek klinicznych.
Do badania włączono łącznie 164 uczestników z podejrzeniem Covid-19. Większość próbek pochodziła z ośrodków leczących (118/164 = 72%), natomiast pozostałych 46 (28%) uczestników pochodziło z ośrodków nieleczących się. Wśród uczestników nieleczonych w ośrodku 15 (9,1%) miało przypadki klinicznie podejrzane, a 31 (18,9%) miało kontakt z potwierdzonymi przypadkami. Dziewięćdziesięciu trzech (56,7%) uczestników stanowili mężczyźni, a średni (± SD) wiek uczestników wynosił 31,10 (± 11,82) lat.
W tym badaniu określono dodatnie i ujemne wskaźniki czterech testów na obecność Covid-19. Zatem wskaźniki dodatnie testu Abbott SARS-CoV-2, testu Daan Gene 2019-nCoV, testu SARS-CoV-2 BGI i testu Sansure Biotech 2019-nCoV wyniosły odpowiednio 59,1%, 58,5%, 57,9% i 55,5%. . Pozytywne i negatywne wyniki złożonego standardu referencyjnego (CRS) wyniosły odpowiednio 97 (59,1%) i 67 (40,9%) (tabela 1). W tym badaniu definicja CRS została oparta na zasadzie „dowolnego pozytywnego”, zgodnie z którą z czterech wyników badań dwa lub więcej wyników, które dały ten sam wynik, uznawano za prawdziwie pozytywne lub negatywne.
W tym badaniu stwierdziliśmy ujemną zgodność procentową (NPA) wynoszącą 100% (95% CI 94,6–100) dla wszystkich analiz w porównaniu z CRS. Analiza Sansure Biotechnology wykazała minimalny PPA na poziomie 93,8% (95% CI 87,2–97,1), a analiza Daan Gene 2019-nCoV wykazała ogólną zgodność na poziomie 99,4% (95% CI 96,6–99,9). Natomiast ogólna zgodność między testem SARS-CoV-2 BGI a testem Sansure Biotech 2019-nCoV wyniosła odpowiednio 98,8% i 96,3% (tabela 2).
Współczynnik kappa Cohena zgodności pomiędzy wynikami testu CRS i Abbott SARS-CoV-2 był w pełni spójny (K = 1,00). Podobnie wartości kappa Cohena wykryte przez Daan Gene 2019-nCoV, SARS-CoV-2 BGI i Sansure Biotech 2019-nCoV są również w pełni zgodne z CRS (K ≥ 0,925). W tej analizie porównawczej test chi-kwadrat (test McNemara) wykazał, że wyniki testu Sansure Biotech 2019-nCoV istotnie różniły się od wyników CRS (p = 0,031) (tabela 2).
Jak pokazano na ryc.1 odsetek najniższej wartości Ct (< 20 Ct) testu Abbott SARS-CoV-2 (połączony gen RdRp i N) wyniósł 87,6%, a wartość Ct genu ORF1a/b testu Sansure Biotech 2019-nCoV wykazała, że ​​odsetek niskich Wartość Ct (< 20 Ct) wyniosła 50,3%, a wysoka wartość Ct (36–40 Ct) 3,2%. 1 odsetek najniższej wartości Ct (< 20 Ct) testu Abbott SARS-CoV-2 (połączony gen RdRp i N) wyniósł 87,6%, a wartość Ct genu ORF1a/b testu Sansure Biotech 2019-nCoV wykazała, że ​​odsetek niskich Wartość Ct (< 20 Ct) wyniosła 50,3%, a wysoka wartość Ct (36–40 Ct) 3,2%.Jak pokazano na ryc.1, процент наименьшего значения Ct (< 20 Ct) анализа Abbott SARS-CoV-2 (комбинированный ген RdRp и N) составил 87,6%, а значение Ct гена ORF1a/b анализа Sansure Biotech 2019-nCoV показало что процент низкого значения Ct (< 20 Ct) составлял 50,3%, а высокое значение Ct (36–40 Ct) wynosi 3,2%. 1, procent najniższej wartości Ct (< 20 Ct) z analizy Abbott SARS-CoV-2 (połączony gen RdRp i N) wyniósł 87,6%, a wartość Ct z analizy genu ORF1a/b firmy Sansure Biotech 2019-nCoV wykazała że odsetek niskich wartości Ct (< 20 Ct) stanowił 50,3%, a wysokich wartości Ct (36–40 Ct) stanowiło 3,2%.如图1 所示, Abbott SARS-CoV-2 检测 (结合RdRp 和N 基因) 的最低Ct 值百分比 (< 20 Ct) 87,6%, Sansure Biotech 2019-nCoV 检测的ORF1a/b 基因Ct 值显示低Ct 值(< 20 Ct) 的百分比为50,3%，高Ct 值(36–40 Ct)的百分比为3,2%. Jak pokazano na rysunku 1, najniższa wartość procentowa Ct (< 20 Ct) testu Abbott SARS-CoV-2 (połączenie genu RdRp i N) wynosi 87,6%, wartość Ct genu ORF1a/b testu Sansure Biotech 2019-nCoV pokazuje niski współczynnik Ct值(< 20 Ct) 的 procent wynosi 50,3%, 高Ct Procent 值(36–40 Ct) 的 wynosi 3,2%. Как показано на рисунке 1, анализ Abbott SARS-CoV-2 (сочетающий гены RdRp и N) имел самое низкое процентное wysokie Ct (< 20 Ct) w normie 87,6%, najwyższe Ct w ORF1a/b w opinii Sansure Biotech 2019- Анализ nCoV показал низкий Ct. Jak pokazano na rycinie 1, test Abbott SARS-CoV-2 (łączący geny RdRp i N) miał najniższą procentową wartość Ct (< 20 Ct) na poziomie 87,6%, podczas gdy wartość Ct genu ORF1a/b w teście Sansure Badanie Biotech 2019 – Analiza nCoV wykazała niski Ct. Процент значений (< 20 Ct) составил 50,3%, а процент высоких значений Ct (36–40 Ct) составил 3,2%. Odsetek wartości (< 20 Ct) wyniósł 50,3%, a odsetek wysokich wartości Ct (36–40 Ct) 3,2%.Test Abbott SARS-CoV-2 B zanotował wartości Ct powyżej 30. Z kolei w teście BGI SARS-CoV-2 gen ORF1a/b miał wysoką wartość Ct (> 36 Ct) i odsetek ten wyniósł 4% (ryc. 1). Z kolei w teście BGI SARS-CoV-2 gen ORF1a/b miał wysoką wartość Ct (> 36 Ct) i odsetek ten wyniósł 4% (ryc. 1). С другой стороны, в анализе BGI SARS-CoV-2 ген ORF1a/b имел высокое значение Ct (> 36 Ct), процент которого составлял 4% (ryc. 1). Natomiast w analizie BGI SARS-CoV-2 gen ORF1a/b charakteryzował się wysoką wartością Ct (> 36 Ct), której odsetek wyniósł 4% (ryc. 1).另一方面，在BGI SARS-CoV-2 检测中，ORF1a/b 基因具有高Ct 值（> 36 Ct）的百分比为4%（图1）。 Natomiast w detekcji BGI SARS-CoV-2 odsetek genu ORF1a/b o wysokiej wartości Ct (>36 Ct) wynosi 4% (ryc. 1). С другой стороны, в анализе BGI SARS-CoV-2 процент генов ORF1a/b z высокими значениями Ct (>36 Ct) составил 4% (рис. 1). Natomiast w analizie BGI SARS-CoV-2 odsetek genów ORF1a/b o wysokich wartościach Ct (>36 Ct) wyniósł 4% (ryc. 1).
W tym badaniu pobraliśmy 164 próbki z nosogardzieli. W przypadku wszystkich typów testów izolację i amplifikację RNA przeprowadzono przy użyciu metod i zestawów zalecanych przez odpowiednich producentów.
Badanie to wykazało, że test firmy Abbott na SARS-CoV-2 ma taką samą skuteczność wykrywania jak CRS, przy 100% zgodności dodatniej, ujemnej i ogólnej. Zgodność kappa Cohena wynosi 1,00, co oznacza pełną zgodność z CRS. Podobne badanie przeprowadzone na Uniwersytecie Waszyngtońskim w USA wykazało, że ogólna czułość i swoistość testu Abbott na SARS-CoV-2 wyniosła odpowiednio 93% i 100% w porównaniu z testem laboratoryjnym (LDA) CDC . 11. System wykrywania SARS-CoV-2 firmy Abbott opiera się na jednoczesnym łącznym wykrywaniu genów N i RdRp, ponieważ oba geny są bardziej czułe, co minimalizuje liczbę wyników fałszywie ujemnych12. Badanie przeprowadzone w Wiedniu w Austrii wykazało również, że duże objętości próbek ekstrakcji i objętości eluentu do wykrywania minimalizują skutki rozcieńczenia i zwiększają skuteczność wykrywania13. Zatem idealne dopasowanie firmy Abbott do testu SARS-CoV-2 można powiązać z platformowym systemem detekcji, który jednocześnie wykrywa geny kombinatoryczne, ekstrahuje dużą liczbę próbek (0,5 ml) i wykorzystuje dużą ilość eluentu (40 µl).
Nasze wyniki pokazały również, że skuteczność wykrywania testu genetycznego Daan była prawie taka sama jak testu CRS. Jest to zgodne z badaniem14 przeprowadzonym na Uniwersytecie Anhui w Huainan w Chinach i twierdzeniem producenta o 100% pozytywnej zgodności. Pomimo raportów o spójnych wynikach, jedna próbka była fałszywie ujemna po ponownym badaniu tego samego eluatu, ale dała wynik pozytywny w testach Abbott SARS-CoV-2 i Sansure Biotech nCoV-2019. Sugeruje to, że mogą występować różnice w wynikach różnych typów testów. Niemniej jednak w badaniu przeprowadzonym w Chinach15 wynik testu Daan Gene był znacząco różny (p < 0,05) w porównaniu z laboratoryjnym testem referencyjnym. Niemniej jednak w badaniu przeprowadzonym w Chinach15 wynik testu Daan Gene był znacząco różny (p < 0,05) w porównaniu z laboratoryjnym testem referencyjnym. Тем не менее, в исследовании, проведенном в Китае15, результат анализа Daan Gene значительно отличался (p < 0,05) от их лабораторного эталонного анализа. Jednakże w badaniu przeprowadzonym w Chinach15 wynik analizy Daan Gene znacząco różnił się (p < 0,05) od laboratoryjnej analizy referencyjnej.然而,在中国进行的研究中15,大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差异 (p < 0,05).然而,在中国进行的研究中15,大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差<0,05 Однако в исследовании, проведенном в Китае15, результаты генетического teста Daan значительно отличались (p < 0,05) по сравнению с его эталонным лабораторным тестом. Jednakże w badaniu przeprowadzonym w Chinach15 wyniki testu genetycznego Daana różniły się istotnie (p < 0,05) w porównaniu z referencyjnym testem laboratoryjnym.Ta rozbieżność może wynikać z czułości testu referencyjnego w wykrywaniu SARS-CoV-2, a dalsze badania mogą być istotne w celu ustalenia przyczyny.
Ponadto w naszym badaniu oceniano skuteczność porównawczą testu BGI SARS-CoV-2 z CRS, wykazując doskonałą zgodność procentową dodatnią (PPA = 97,9%), zgodność procentową ujemną (NPA = 100%) i ogólną zgodność procentową według płci ( OPA). ). = 98,8%). Wartości Kappa Cohena wykazały dobrą zgodność (K = 0,975). Badania przeprowadzone w Holandii16 i Chinach15 wykazały spójne wyniki. Test SARS-CoV-2 BGI to test do wykrywania pojedynczego genu (ORF1a/b) przy użyciu 10 µl eluatu amplifikacyjnego/detekcyjnego. Pomimo dobrej zgodności statystycznej z naszymi wynikami referencyjnymi, w analizie pominięto dwie próbki pozytywne (1,22%) z całej próbki. Może to mieć ogromne implikacje kliniczne dla dynamiki transmisji zarówno na poziomie pacjenta, jak i społeczności.
Kolejną analizą porównawczą uwzględnioną w tym badaniu był test Sansure Biotech nCoV-2019 rRT-PCR (RUO); ogólny procent dopasowania wyniósł 96,3%. O sile zgodności zdecydowała także wartość Kappa Cohena, która wyniosła 0,925, co oznacza pełną zgodność z CRS. Ponownie nasze wyniki są identyczne z badaniami przeprowadzonymi na Central South University w Changsha w Chinach oraz na Oddziale Laboratorium Klinicznego Szpitala Ludowego Liuzhou w mieście Liuzhou w Chinach17. Mimo że stwierdzono powyższą dobrą zgodność statystyczną, test chi-kwadrat (test MacNemara) wykazał, że wynik testu Sansure Biotech różnił się istotnie statystycznie w porównaniu z CRS (p < 0,005). Mimo że stwierdzono powyższą dobrą zgodność statystyczną, test chi-kwadrat (test MacNemara) wykazał, że wynik testu Sansure Biotech różnił się istotnie statystycznie w porównaniu z CRS (p < 0,005). Несмотря на то, что было зафиксировано указанное выыше хорошее статистическое соответствие, критерий хи-квадрат (критерий Макнемара) показал, что результат анализа Sansure Biotech имеет статистически значимое различие по сравнению с CRS (p < 0,005). Mimo że powyżej odnotowano dobrą zgodność statystyczną, test chi-kwadrat (test McNemara) wykazał, że wynik testu Sansure Biotech różnił się statystycznie istotnie w porównaniu z CRS (p < 0,005).尽管记录了上述良好的统计一致性, 但卡方检验 (MacNemar 检验), 表明, Sansure Biotech 检测的结果与CRS相比具有统计学显着差异(p < 0,005).尽管 记录 了 上述 良好 统计 一致性 ， 但 检验 （（macnemar 检验 表明 ， ， sansure biotech 检测 结果与 crs 相比 具有 显着 （(p <0,005。。。。。。。。。。。。。。。。。。。））)) Несмотря на отмеченное выше хорошее статистическое соответствие, критерий хи-квадрат (критерий Макнемара) показал статистически значимую разницу (p < 0,005) между анализом Sansure Biotech i CRS. Pomimo dobrej zgodności statystycznej odnotowanej powyżej, test chi-kwadrat (test McNemara) wykazał statystycznie istotną różnicę (p < 0,005) pomiędzy testem Sansure Biotech i CRS.Stwierdzono, że sześć próbek (3,66%) dało wynik fałszywie ujemny w porównaniu z CRS (tabela uzupełniająca 1); jest to bardzo ważne, szczególnie biorąc pod uwagę dynamikę przenoszenia wirusa. Powyższe dane również potwierdzają ten niski wskaźnik wykrywalności15.
W tym badaniu określono wartości Ct dla każdego testu i odpowiedniej platformy, przy czym najniższą średnią wartość Ct odnotowano w teście Abbott SARS-CoV-2. Wynik ten może być powiązany z systemem jednoczesnego kombinowanego badania genetycznego firmy Abbott do wykrywania SARS-CoV-2. Dlatego też, zgodnie z ryc. 1, 87,6% wyników firmy Abbott SARS-CoV-2 miało wartości Ct poniżej 20. Tylko niewielka liczba wyników próbek (12,4%) mieściła się w przedziale 20-30. Nie rejestrowano wartości Ct powyżej 30. Oprócz wykorzystania przez firmę Abbott formatu panelu genetycznego testu SARS-CoV-2, wynik ten może być powiązany z dolną granicą wykrywalności (32,5 kopii RNA/ml)18, która jest trzykrotnie niższa niż dolny limit firmy wynoszący 100 kopii RNA /ml. ml)19.
To badanie ma pewne ograniczenia: po pierwsze, nie dysponujemy metodami standardowymi/referencyjnymi [takimi jak wiremia lub inne testy laboratoryjne (LDA)] ze względu na brak zasobów. Po drugie, wszystkie próbki użyte w tym badaniu były wymazami z nosogardzieli, podczas gdy wyników nie można było zastosować do innych typów próbek, a po trzecie, wielkość naszej próbki była niewielka.
W tym badaniu porównano skuteczność czterech testów rRT-PCR na obecność SARS-CoV-2 z wykorzystaniem próbek z nosogardzieli. Wszystkie testy wykrywające miały prawie porównywalną skuteczność, z wyjątkiem testu Sansure Biotech. Poza tym, w teście Sansure Biotech stwierdzono niski odsetek wyników pozytywnych w porównaniu z CRS (p < 0,05). Poza tym, w teście Sansure Biotech stwierdzono niski odsetek wyników pozytywnych w porównaniu z CRS (p < 0,05). Krzesło, w testeście Sansure Biotech, który jest jednym z kluczowych ekspertów w sprawie CRS (p < 0,05). Dodatkowo test Sansure Biotech wykazał niski odsetek wyników pozytywnych w porównaniu do CRS (p < 0,05).此外, 与CRS 相比, Sansure Biotech 检测的阳性率较低(p < 0,05).此外, 与CRS 相比, Sansure Biotech 检测的阳性率较低(p < 0,05). Lek ten, analizowany przez firmę Sansure Biotech, jest jednym z najbardziej innowacyjnych środków stosowanych w CRS (p < 0,05). Ponadto test Sansure Biotech charakteryzował się niższym współczynnikiem dodatniości w porównaniu z CRS (p < 0,05).Analiza Sansure Biotech nCoV-2019 (RUO) dotycząca PPA, NPA i ogólnej zgodności przekroczyła 93,5% przy wartości zgodności siły Cohena Kappa wynoszącej 0,925. Wreszcie, test Sansure Biotech Assay (RUO) wymaga dalszej walidacji do stosowania w Etiopii i należy rozważyć dodatkowe badania w celu oceny oświadczeń poszczególnych producentów.
Badania porównawcze przeprowadzono w czterech placówkach służby zdrowia w Addis Abebie, szpitalu Eka Kotebe, Centrum Leczenia Kościoła Millennium, Szpitalu Zewooditu Memorial i Szpitalu Specjalistycznym ds. Gruźlicy św. Piotra. Dane zebrano między 1 a 31 grudnia 2020 r. Placówki medyczne do tego badania zostały wybrane celowo ze względu na dużą liczbę przypadków i dostępność głównych ośrodków terapeutycznych w mieście. Podobnie instrumenty, w tym instrumenty do PCR w czasie rzeczywistym ABI 7500 i Abbott m2000, zostały wybrane zgodnie z zaleceniami producentów odczynników NAAT, a do tego badania wybrano cztery zestawy do wykrywania PCR, ponieważ większość laboratoriów w Etiopii używała co najmniej co najmniej cztery z nich. Test genowy, test Abbott SARS-CoV-2, test Sansure Biotech i test SARS-CoV-2 BGI wykonywane w trakcie badania).
Testy na obecność SARS-CoV-2 przeprowadzono w dniach 1–30 grudnia 2020 r. przy użyciu 3 ml podłoża transportowego wirusa (VTM) (Miraclean Technology, Shenzhen, Chiny) od osób objętych dochodzeniem w kierunku COVID-19 i skierowanych do EPHI. Próbki z nosogardzieli zostały pobrane przez przeszkolonych zbieraczy próbek i przesłane do EPHI w potrójnych opakowaniach. Przed izolacją kwasu nukleinowego każdej próbce przypisywany jest unikalny numer identyfikacyjny. Ekstrakcja przeprowadzana jest z każdej próbki natychmiast po jej otrzymaniu, przy zastosowaniu metod ekstrakcji ręcznej i automatycznej. Zatem w celu automatycznej ekstrakcji Abbott m2000 z każdej próbki wyekstrahowano 1,3 ml (w tym 0,8 ml objętości martwej i 0,5 ml objętości wlotu ekstrakcji) i przepuszczono przez system przygotowania próbki Abbott DNA (Abbott Molecular Inc. des Plaines, Illinois, USA). ) Partię 96 [92 próbki, dwie kontrole wykrywające i dwie kontrole bez szablonu (NTC)] uwzględniono w ogólnym procesie (pobieraniu i wykrywaniu) dwóch rund SARS-CoV-2 (EUA) w czasie rzeczywistym. górnictwo. Podobnie w przypadku ekstrakcji ręcznej należy użyć tych samych próbek (w przypadku ekstrakcji automatycznej i wykrywania). Zatem w trakcie całego procesu 140 µl próbek podzielono na porcje i ekstrahowano przy użyciu zestawu QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Niemcy) w partiach po 24 (w tym 20 próbek, dwie kontrole testu i dwie NTC) w ciągu dziewięciu rund. Ręcznie ekstrahowane eluaty amplifikowano i wykrywano przy użyciu termocyklera ABI 7500, stosując test SARS-CoV-2 BGI, test Daan Gene i test Sansure Biotech.
Zautomatyzowana izolacja i oczyszczanie RNA wirusa SARS-CoV-2 opiera się na zasadzie kulki magnetycznej przy użyciu odczynników do przygotowywania próbek DNA firmy Abbott. Inaktywację próbek i solubilizację cząstek wirusa przeprowadza się przy użyciu detergentu zawierającego izotiocyjanian guanidyny w celu denaturacji białka i inaktywacji RNazy. Następnie RNA oddziela się od białka metodą rozdziału w fazie stałej przy użyciu krzemionki, tj. sól guanidyniowa i zasadowe pH buforu do lizy sprzyjają wiązaniu kwasów nukleinowych z krzemionką (SiO2). Etap płukania usuwa pozostałe białka i zanieczyszczenia, tworząc klarowny roztwór. Przezroczysty RNA izoluje się z mikrocząstek na bazie krzemionki za pomocą pola magnetycznego instrumentu20,21. Natomiast ręczna izolacja i oczyszczanie RNA odbywa się metodą wirówkowej kolumny, wykorzystując wirowanie zamiast stojaka magnetycznego i oddzielanie mikrocząstek od eluentu.
Test wykrywania SARS-CoV-2 w czasie rzeczywistym firmy Abbott (Abbott Molecular, Inc.) przeprowadzono zgodnie z instrukcjami producenta, który otrzymał EUA19,22 od WHO i FDA. W tym protokole inaktywację próbki przed ekstrakcją przeprowadzono w łaźni wodnej w temperaturze 56°C przez 30 minut. Po inaktywacji wirusa przeprowadzono ekstrakcję kwasu nukleinowego na aparacie Abbott m2000 SP z 0,5 ml VTM, stosując system przygotowania próbki DNA Abbott m2000. według producenta. Amplifikację i detekcję przeprowadzono przy użyciu urządzenia Abbott m2000 RT-PCR, a podwójną detekcję przeprowadzono dla genów RdRp i N. ROX) i VIC P (zastrzeżony barwnik) do namierzania i wykrywania kontroli wewnętrznych, umożliwiających jednoczesne wykrywanie obu produktów amplifikacji 19 .
Metoda wykrywania amplifikacji zastosowana w tym zestawie opiera się na jednoetapowej technologii RT-PCR. Geny ORF1a/b i N wybrano jako regiony konserwatywne za pomocą technologii Daan Gene Technology w celu wykrycia amplifikacji regionu docelowego. Specyficzne startery i sondy fluorescencyjne (sondy genu N znakowane FAM, sondy ORF1a/b znakowane VIC) zostały zaprojektowane do wykrywania RNA SARS-CoV-2 w próbkach. Końcowy eluent i mieszaniny główne przygotowano przez dodanie 5 µl eluentu do 20 µl mieszaniny głównej do końcowej objętości 25 µl. Amplifikację i detekcję przeprowadzono jednocześnie na aparacie do PCR w czasie rzeczywistym ABI 750024.
Geny ORF1a/b i N wykryto przy użyciu zestawu Sansure Biotech nCoV-2019 Nucleic Acid Diagnostic Kit (detekcja fluorescencyjna PCR). Przygotuj specyficzne sondy dla każdego genu docelowego, wybierając kanał FAM dla regionu ORF1a/b i kanał ROX dla genu N. Do tego zestawu testowego dodaje się eluent i odczynniki master mix w następujący sposób: przygotować 30 µl odczynnika master mix i 20 µl eluowanej próbki do detekcji/amplifikacji. Do amplifikacji/detekcji zastosowano PCR w czasie rzeczywistym ABI 750025.
Test SARS-CoV-2 BGI to fluorescencyjny zestaw rRT-PCR w czasie rzeczywistym do diagnozowania COVID-19. Region docelowy znajduje się w regionie ORF1a/b genomu SARS-CoV-2, co jest metodą wykrywania pojedynczego genu. Ponadto ludzki gen metabolizmu podstawowego β-aktyna jest genem docelowym regulowanym wewnętrznie. Master mix przygotowuje się poprzez zmieszanie 20 µl odczynnika master mix i 10 µl wyekstrahowanej próbki RNA w płytce ze studzienkami26. Do amplifikacji i detekcji wykorzystano fluorescencyjny przyrząd do ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym ABI 7500. Amplifikację wszystkich kwasów nukleinowych, warunki reakcji PCR dla każdego testu i interpretację wyników przeprowadzono zgodnie z instrukcjami odpowiedniego producenta (Tabela 3).
W tej analizie porównawczej nie zastosowaliśmy standardowej metody referencyjnej do określenia procentowej zgodności (pozytywnej, negatywnej i ogólnej) ani innych parametrów porównawczych dla czterech analiz. Każde porównanie testów zostało wykonane przy użyciu CRS, w tym badaniu CRS ustalono według zasady „dowolny pozytywny”, a wynik został ustalony, a nie na podstawie pojedynczego testu, wykorzystaliśmy co najmniej dwa zgodne wyniki testów. Ponadto w przypadku transmisji COVID-19 wyniki fałszywie ujemne są bardziej niebezpieczne niż wyniki fałszywie dodatnie. Dlatego też, aby jak najdokładniej powiedzieć „pozytywny” na podstawie wyniku CRS, co najmniej dwa testy muszą być pozytywne, co oznacza, że ​​co najmniej jeden pozytywny wynik prawdopodobnie pochodzi z testu EUA. Zatem spośród czterech wyników testów dwa lub więcej wyników dających ten sam wynik uważa się za prawdziwie pozytywne lub negatywne18,27.
Dane zebrano przy użyciu ustrukturyzowanych formularzy do ekstrakcji danych, wprowadzanie danych i analizę przeprowadzono przy użyciu oprogramowania statystycznego Excel i SPSS w wersji 23.0 do statystyk opisowych. Przeanalizowano dodatnią, ujemną i ogólną zgodność procentową, a do określenia stopnia zgodności każdej metody z CRS zastosowano wynik Kappa. Wartości Kappa interpretuje się następująco: 0,01–0,20 dla umiarkowanej zgodności, 0,21–0,40 dla ogólnej zgodności, 0,41–0,60 dla umiarkowanej zgodności, 0,61–0,80 dla dużej zgodności i 0,81–0,99 dla całkowitej zgodności28.
Uzyskano zezwolenie etyczne na Uniwersytecie w Addis Abebie, a wszystkie protokoły eksperymentalne dla tego badania zostały zatwierdzone przez Komisję Rewizyjną ds. Etyki Naukowej Etiopskiego Instytutu Zdrowia Publicznego. Numer referencyjny licencji etycznej EPHI to EPHI/IRB-279-2020. Wszystkie metody zastosowano zgodnie z zaleceniami i postanowieniami Etiopskich Narodowych Kompleksowych Wytycznych dotyczących Leczenia COVID-19. Ponadto przed wzięciem udziału w badaniu uzyskano pisemną świadomą zgodę od wszystkich uczestników badania.
Wszystkie dane uzyskane lub przeanalizowane w tym badaniu znajdują się w tym opublikowanym artykule. Dane potwierdzające wyniki tego badania są dostępne u odpowiedniego autora na uzasadnioną prośbę.
Światowa Organizacja Zdrowia. Zalecenia dotyczące strategii badań laboratoryjnych w kierunku COVID-19: Tymczasowe wytyczne, 21 marca 2020 r. nr WHO/2019-nCoV/lab_testing/2020.1 (WHO, 2020).
Mouliou, DS, Pantazopoulos, I. & Gourgoulianis, KI Inteligentna diagnostyka COVID-19 na oddziale ratunkowym: wszystko w praktyce. Mouliou, DS, Pantazopoulos, I. & Gourgoulianis, KI Inteligentna diagnostyka COVID-19 na oddziale ratunkowym: wszystko w praktyce.Muliou, DS, Pantazopoulos, I. i Gurgulianis, KI Inteligentna diagnoza COVID-19 na oddziale ratunkowym: wszystko w praktyce.Muliou DS, Pantazopoulos I. i Gurgulyanis KI Inteligentna diagnostyka COVID-19 na oddziałach ratunkowych: kompleksowa integracja w praktyce. Ekspert, wielebny Respire. medycyna. 3, 263–272 (2022).
Mitchell, SL i St George, K. Ocena testu COVID19 ID NOW EUA. Mitchell, SL i St George, K. Ocena testu COVID19 ID NOW EUA.Mitchell, SL i St. George, K. Ocena testu COVID19 ID NOW EUA.Mitchell SL i St. George K. Ocena testu COVID19 ID NOW EUA. J. Kliniczny. Wirus. 128, 104429. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104429 (2020).
KTO. Laboratoryjne wykrywanie choroby koronawirusowej 2019 (COVID-19) w przypadku podejrzenia choroby u ludzi. https://www.who.int/publications/i/item/10665-331501 (dostęp: 15 sierpnia 2020 r.) (WHO, 2020).
Udugama, B. i in. Diagnoza COVID-19: choroby i narzędzia testowe. ACS Nano 14(4), 3822–3835 (2020).
Syed S. i in. Utworzenie Kolegium Patologów Afryki Wschodniej, Środkowej i Południowej – Regionalnej Szkoły Patologii Bliskiego Wschodu i Republiki Południowej Afryki. Afryka. J.Lab. medycyna. 9 ust. 1, 1-8 (2020).
Etiopski Instytut Zdrowia Publicznego, Federalne Ministerstwo Zdrowia. Tymczasowa krajowa strategia i wytyczne dotyczące diagnostyki laboratoryjnej COVID-19. https://ephi.gov.et/images/novel_coronavirus/EPHI_PHEOC_COVID-19_Laboratory_Diagnosis_Eng.pdf (dostęp: 12 sierpnia 2020 r.) (EPHI, 2020).
Woloshin, S., Patel, N. i Kesselheim, AS Fałszywie negatywne testy na wyzwania i implikacje związane z infekcją SARS-CoV-2. Woloshin, S., Patel, N. i Kesselheim, AS Fałszywie negatywne testy na wyzwania i implikacje związane z infekcją SARS-CoV-2.Voloshin S., Patel N. i Kesselheim AS Fałszywie ujemne testy na obecność infekcji SARS-CoV-2 i ich następstw.Voloshin S., Patel N. i Kesselheim AS Fałszywie ujemne testy na prowokację i wpływ zakażenia SARS-CoV-2. N. inż. J. Medycyna. 383 ust. 6, e38 (2020).
Mouliou, DS i Gourgoulianis, KI Fałszywie dodatnie i fałszywie ujemne przypadki COVID-19: strategie zapobiegania i zarządzania układem oddechowym, szczepienia i dalsze perspektywy. Mouliou, DS i Gourgoulianis, KI Fałszywie dodatnie i fałszywie ujemne przypadki COVID-19: strategie zapobiegania i zarządzania układem oddechowym, szczepienia i dalsze perspektywy. Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI Ложноположительные i ложноотрицательные случаи COVID-19: респираторная профилактик и стратегии лечения, вакцинация и дальнейшие перспективы. Mouliou, DS i Gourgoulianis, KI Fałszywie dodatnie i fałszywie ujemne przypadki COVID-19: strategie zapobiegania i leczenia dróg oddechowych, szczepienia i dalsze działania.Muliu, DS i Gurgulianis, KI Fałszywie dodatnie i fałszywie ujemne przypadki Covid-19: strategie zapobiegania i leczenia układu oddechowego, szczepienia i dalsze działania. Ekspert, wielebny Respire. medycyna. 15 ust. 8, 993–1002 (2021).
Mouliou, DS, Ioannis, P. i Konstantinos, G. Diagnoza COVID-19 na oddziale ratunkowym: widzieć drzewo, ale tracić las. Mouliou, DS, Ioannis, P. i Konstantinos, G. Diagnoza COVID-19 na oddziale ratunkowym: widzieć drzewo, ale tracić las.Mouliou, DS, Ioannis, P. i Konstantinos, G. Diagnoza COVID-19 na oddziale ratunkowym: Zobacz drzewo, zgub las.Muliou DS, Ioannis P. i Konstantinos G. Diagnoza COVID-19 na oddziałach ratunkowych: Za mało lasu dla drzew. Pojawić się. medycyna. J. https://doi.org/10.1136/emermed-2021-212219 (2022).
Degli-Angeli, E. i in. Walidacja i walidacja wydajności analitycznej i klinicznej testu Abbott RealTime SARS-CoV-2. J. Kliniczny. Wirus. 129, 104474. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104474 (2020).
Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. i Aflatoonian, B. Porównanie pięciu zestawów starterów z różnych regionów genomu COVID-19 do wykrywania infekcji wirusowej konwencjonalną metodą RT-PCR. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. i Aflatoonian, B. Porównanie pięciu zestawów starterów z różnych regionów genomu COVID-19 do wykrywania infekcji wirusowej za pomocą konwencjonalnego RT-PCR.Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. i Aflatunyan, B. Porównanie pięciu zestawów starterów z różnych regionów genomu COVID-19 do wykrywania infekcji wirusowej konwencjonalną metodą RT-PCR. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. 比较来自COVID-19不同基因组区域的五个引物组,用于通过常规RT-PCR 检测病毒感染. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. i Aflatoonian, B. Porównanie 5 różnych regionów genetycznych COVID-19 w celu wykrycia infekcji wirusowej konwencjonalną metodą RT-PCR.Mollaei HR, Afshar AA, Kalantar-Neyestanaki D, Fazlalipour M. i Aflatunyan B. Porównanie pięciu zestawów starterów z różnych regionów genomu COVID-19 do wykrywania infekcji wirusowej konwencjonalną metodą RT-PCR.Iran. J. Mikrobiologia. 12 ust. 3, 185 (2020).
Goertzer, I. i in. Wstępne wyniki krajowego programu zewnętrznej oceny jakości wykrywania sekwencji genomu SARS-CoV-2. J. Kliniczny. Wirus. 129, 104537. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104537 (2020).
Wang, M. i in. Analityczna ocena skuteczności pięciu zestawów RT-PCR dla wirusa ciężkiego ostrego zespołu oddechowego 2. J. Clinical. laboratorium. odbyt. 35 ust. 1, e23643 (2021).
Wang B. i in. Ocena siedmiu dostępnych na rynku zestawów do wykrywania RNA SARS-CoV-2 w Chinach w oparciu o reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) w czasie rzeczywistym. kliniczny. Chemiczny. laboratorium. medycyna. 58 ust. 9, e149–e153 (2020).
van Casteren, PB i in. Porównanie siedmiu komercyjnych zestawów diagnostycznych RT-PCR COVID-19. J. Kliniczny. Wirus. 128, 104412 (2020).
Lu, Yu i in. Porównanie wydajności diagnostycznej dwóch zestawów PCR do wykrywania kwasów nukleinowych SARS-CoV-2. J. Kliniczny. laboratorium. odbyt. 34(10), e23554 (2020).
Lefart, PR itp. Badanie porównawcze czterech platform do testowania amplifikacji kwasu nukleinowego (NAAT) SARS-CoV-2 wykazało, że skuteczność ID NOW znacznie się pogorszyła w zależności od pacjenta i rodzaju próbki. diagnoza. mikrobiologia. Infekować. diss. 99 ust. 1, 115200 (2021).
Cząsteczka Abbotta. Ulotka dołączona do pakietu analizy SARS-CoV-2 firmy Abbott. https://www.molecular.abbott/us/en/products/infectious-disease/RealTime-SARS-CoV-2-Assay. 1-12. (Stan na 10 sierpnia 2020 r.) (2020).
Klein, S. i in. Izolacja RNA SARS-CoV-2 przy użyciu kulek magnetycznych do szybkiej detekcji na dużą skalę metodami RT-qPCR i RT-LAMP. Wirus 12(8), 863 (2020).