Czynniki zakłócające w reakcjach PCR

Podczas reakcji PCR często spotyka się czynniki zakłócające.
Ze względu na bardzo wysoką czułość PCR zanieczyszczenie jest uważane za jeden z najważniejszych czynników wpływających na wyniki PCR i może dawać wyniki fałszywie dodatnie.
Równie krytyczne są różne źródła, które prowadzą do wyników fałszywie ujemnych.Jeśli jedna lub więcej istotnych części mieszaniny PCR lub sama reakcja amplifikacji są hamowane lub zakłócane, test diagnostyczny może być utrudniony.Może to prowadzić do zmniejszenia wydajności, a nawet wyników fałszywie ujemnych.
Oprócz hamowania może wystąpić utrata integralności docelowego kwasu nukleinowego z powodu warunków transportu i/lub przechowywania przed przygotowaniem próbki.W szczególności wysokie temperatury lub nieodpowiednie przechowywanie mogą prowadzić do uszkodzenia komórek i kwasów nukleinowych.Utrwalanie komórek i tkanek oraz zatapianie w parafinie to dobrze znane przyczyny fragmentacji DNA i utrzymującego się problemu (patrz Ryc. 1 i 2).W takich przypadkach nawet optymalna izolacja i oczyszczenie nie pomoże.

Rysunek 1 |Wpływ immobilizacji na integralność DNA
Elektroforeza w żelu agarozowym wykazała, że ​​jakość DNA wyizolowanego ze skrawków parafinowych autopsji była bardzo zróżnicowana.W ekstraktach występował DNA o różnej średniej długości fragmentów w zależności od metody utrwalania.DNA zostało zachowane tylko po utrwaleniu w natywnych zamrożonych próbkach iw buforowanej obojętnej formalinie.Zastosowanie silnie kwaśnego utrwalacza Bouina lub niebuforowanej formaliny zawierającej kwas mrówkowy powodowało znaczną utratę DNA.Pozostała frakcja jest silnie rozdrobniona.
Po lewej długość fragmentów wyrażona w kiloparach zasad (kbp)

Rysunek 2 |Utrata integralności docelowych kwasów nukleinowych
(a) Przerwa 3′-5′ na obu niciach spowoduje pęknięcie w docelowym DNA.synteza DNA będzie nadal zachodzić na małym fragmencie.Jeśli jednak na fragmencie DNA brakuje miejsca przyłączania starterów, zachodzi tylko amplifikacja liniowa.W najkorzystniejszym przypadku fragmenty mogą wzajemnie się nasycać, ale wydajność będzie niewielka i poniżej poziomu wykrywalności.
(b) Utrata zasad, głównie z powodu depurynacji i tworzenia dimeru tymidyny, prowadzi do zmniejszenia liczby wiązań wodorowych i zmniejszenia Tm.Podczas wydłużonej fazy rozgrzewania, startery topią się z matrycy DNA i nie ulegają hybrydyzacji nawet w mniej surowych warunkach.
(c) Sąsiednie zasady tyminy tworzą dimer TT.
Innym częstym problemem, który często pojawia się w diagnostyce molekularnej, jest mniej niż optymalne uwalnianie docelowych kwasów nukleinowych w porównaniu z ekstrakcją fenolowo-chloroformową.W skrajnych przypadkach może to być związane z fałszywymi negatywami.Wiele czasu można zaoszczędzić przez gotowanie lizy lub trawienie enzymatyczne resztek komórek, ale ta metoda często skutkuje niską czułością PCR z powodu niewystarczającego uwalniania kwasu nukleinowego.

Hamowanie aktywności polimerazy podczas amplifikacji

Ogólnie rzecz biorąc, inhibicja jest używana jako koncepcja pojemnika do opisania wszystkich czynników, które prowadzą do suboptymalnych wyników PCR.W sensie ściśle biochemicznym inhibicja ogranicza się do aktywności enzymu, tj. zmniejsza lub zapobiega konwersji substratu w produkt poprzez interakcję z miejscem aktywnym polimerazy DNA lub jej kofaktorem (np. Mg2+ dla polimerazy DNA Taq).
Składniki w próbce lub różne bufory i ekstrakty zawierające odczynniki mogą bezpośrednio hamować enzym lub wychwytywać jego kofaktory (np. EDTA), inaktywując w ten sposób polimerazę, co z kolei prowadzi do obniżenia lub fałszywie ujemnych wyników PCR.
Jednak wiele interakcji między składnikami reakcji a kwasami nukleinowymi zawierającymi cel jest również określanych jako „inhibitory PCR”.Gdy integralność komórki zostanie naruszona przez izolację i uwolniony zostanie kwas nukleinowy, mogą wystąpić interakcje między próbką a otaczającym ją roztworem i fazą stałą.Na przykład „zmiatacze” mogą wiązać jedno- lub dwuniciowy DNA poprzez interakcje niekowalencyjne i zakłócać izolację i oczyszczanie, zmniejszając liczbę celów, które ostatecznie docierają do naczynia reakcyjnego PCR.
Ogólnie rzecz biorąc, inhibitory PCR są obecne w większości płynów ustrojowych i odczynników stosowanych w diagnostyce klinicznej (mocznik w moczu, hemoglobina i heparyna we krwi), suplementach diety (składniki organiczne, glikogen, tłuszcz, jony Ca2+) oraz składnikach środowiska (fenole , metale ciężkie)

Bardziej rozpowszechnione inhibitory PCR można znaleźć w bakteriach i komórkach eukariotycznych, niebędącym celem DNA, makrocząsteczkach wiążących DNA w macierzach tkankowych i sprzęcie laboratoryjnym, takim jak rękawiczki i tworzywa sztuczne.Oczyszczanie kwasów nukleinowych podczas lub po ekstrakcji jest preferowaną metodą usuwania inhibitorów PCR.
Obecnie różne zautomatyzowane urządzenia do ekstrakcji mogą zastąpić wiele protokołów ręcznych, ale nigdy nie osiągnięto 100% odzysku i/lub oczyszczenia celów.Potencjalne inhibitory mogą nadal być obecne w oczyszczonych kwasach nukleinowych lub mogły już zadziałać.Istnieją różne strategie zmniejszania wpływu inhibitorów.Wybór odpowiedniej polimerazy może mieć istotny wpływ na aktywność inhibitora.Inne sprawdzone metody zmniejszania inhibicji PCR to zwiększanie stężenia polimerazy lub stosowanie dodatków takich jak BSA.
Hamowanie reakcji PCR można wykazać za pomocą wewnętrznej kontroli jakości procesu (IPC).
Należy zachować ostrożność, aby usunąć wszystkie odczynniki i inne roztwory z zestawu do ekstrakcji, takie jak etanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, izopropanol i fenol, z izolatu kwasu nukleinowego poprzez dokładne przemycie.W zależności od ich stężenia mogą aktywować lub hamować reakcję PCR.