Czynniki interferencyjne w reakcjach PCR

Podczas reakcji PCR często spotykają się niektóre czynniki zakłócające.
Ze względu na bardzo wysoką wrażliwość PCR, zanieczyszczenie jest uważane za jeden z najważniejszych czynników wpływających na wyniki PCR i może przynieść fałszywie pozytywne wyniki.
Równie krytyczne są różne źródła, które prowadzą do wyników fałszywie ujemnych. Jeśli jedna lub więcej podstawowych części mieszaniny PCR lub sama reakcja amplifikacji jest hamowana lub zakłócana, test diagnostyczny może być utrudniony. Może to prowadzić do zmniejszenia wydajności, a nawet wyników fałszywie negatywnych.
Oprócz zahamowania może wystąpić utrata integralności kwasu nukleinowego z powodu warunków wysyłki i/lub przechowywania przed przygotowaniem próbki. W szczególności wysokie temperatury lub nieodpowiednie przechowywanie mogą prowadzić do uszkodzenia komórek i kwasów nukleinowych. Fivation i tkanki i osadzanie parafiny są dobrze znanymi przyczynami fragmentacji DNA i trwałym problemem (patrz ryc. 1 i 2). W takich przypadkach nawet optymalna izolacja i oczyszczanie nie pomogą.

Rysunek 1 | Wpływ unieruchomienia na integralność DNA
Elektroforeza żelowa agarozowa wykazała, że ​​jakość DNA izolowana z odcinków autopsji parafinowych różniła się znacznie. DNA o różnych średnich długościach fragmentów występowało w ekstraktach w zależności od metody fiksacji. DNA zachowano tylko wtedy, gdy utrwalono w rodzimych zamrożonych próbkach i buforowanej neutralnej formalinie. Zastosowanie silnie kwaśnej utrwalającej lub nieskomplikowanej formaliny o kwasach zawierających kwas, spowodowało znaczną utratę DNA. Pozostała frakcja jest bardzo rozdrobniona.
Po lewej stronie długość fragmentów wyraża się w parach kilobazy (KBP)

Rysunek 2 | Utrata integralności celów kwasu nukleinowego
(A) Gap 3'-5 ′ na obu nici spowoduje pęknięcie docelowego DNA. Synteza DNA będzie nadal wystąpić na małym fragmencie. Jeśli jednak w fragmencie DNA brakuje miejsca wyżarzania starterów, zachodzi tylko amplifikacja liniowa. W najprzyerniejszym przypadku fragmenty mogą się nawzajem rozstrzygać, ale plony będą małe i poniżej poziomów wykrywania.
(B) Utrata zasad, głównie z powodu depurinowania i tworzenia dimeru tymidyny, prowadzi do zmniejszenia liczby wiązań H i spadku TM. Podczas wydłużonej fazy ocieplenia startery rozpłyną się od DNA matrycy i nie użądają nawet w mniej rygorystycznych warunkach.
(c) sąsiednie zasady tyminy tworzą dimer TT.
Innym powszechnym problemem, który często występuje w diagnostyce molekularnej, jest mniej niż optymalne uwalnianie docelowych kwasów nukleinowych w porównaniu z ekstrakcją fenol-chloroform. W skrajnych przypadkach może to być powiązane z fałszywymi negatywami. Wiele czasu można zaoszczędzić poprzez gotowanie lizy lub enzymatyczne trawienie resztek komórek, ale metoda ta często powoduje niską wrażliwość PCR z powodu niewystarczającego uwalniania kwasu nukleinowego.

Hamowanie aktywności polimerazy podczas amplifikacji

Zasadniczo hamowanie jest stosowane jako koncepcja pojemnika do opisania wszystkich czynników prowadzących do nieoptymalnych wyników PCR. W ściśle biochemicznym sensie hamowanie ogranicza się do aktywności enzymu, tj. Zmniejsza lub zapobiega konwersji produktu substratu poprzez interakcję z aktywnym miejscem polimerazy DNA lub jej kofaktoru (np. Mg2+ dla polimerazy DNA TAQ).
Składniki w próbce lub różnych buforach i ekstraktach zawierających odczynniki mogą bezpośrednio hamować enzym lub uwięzić jego kofaktory (np. EDTA), inaktywując w ten sposób polimerazę, a z kolei prowadząc do zmniejszonych lub fałszywie ujemnych wyników PCR.
Jednak wiele interakcji między składnikami reakcji a kwasami nukleinowymi zawierającymi cel jest również oznaczonych jako „inhibitory PCR”. Po zakłóceniu integralności komórki przez izolację i uwalnianie kwasu nukleinowego, mogą wystąpić interakcje między próbką a otaczającą roztworem a fazą stałą. Na przykład „padlinożercy” mogą wiązać pojedyncze lub dwuniciowe DNA poprzez nieokowalne interakcje i zakłócać izolację i oczyszczanie poprzez zmniejszenie liczby celów, które ostatecznie docierają do naczynia reakcyjnego PCR.
Zasadniczo inhibitory PCR występują w większości płynów ustrojowych i odczynników stosowanych do klinicznych testów diagnostycznych (mocz w moczu, hemoglobinie i heparyna we krwi), suplementach diety (składniki organiczne, glikogen, tłuszcz, jony CA2+) oraz elementy w środowisku (fenole, metale ciężkie)

Bardziej rozpowszechnione inhibitory PCR można znaleźć w bakteriach i komórkach eukariotycznych, nieokalowym DNA, makrocząsteczkach wiążących DNA matryc tkankowych i sprzętu laboratoryjnego, takich jak rękawiczki i tworzywa sztuczne. Oczyszczanie kwasów nukleinowych podczas lub po ekstrakcji jest preferowaną metodą usuwania inhibitorów PCR.
Obecnie różne zautomatyzowane urządzenia do ekstrakcji mogą zastąpić wiele ręcznych protokołów, ale 100% odzyskiwania i/lub oczyszczanie celów nigdy nie zostało osiągnięte. Potencjalne inhibitory mogą być nadal obecne w oczyszczonych kwasach nukleinowych lub mogły już zająć się. Istnieją różne strategie w celu zmniejszenia wpływu inhibitorów. Wybór odpowiedniej polimerazy może mieć znaczący wpływ na aktywność inhibitora. Inne sprawdzone metody ograniczenia hamowania PCR są zwiększenie stężenia polimerazy lub stosowanie dodatków, takich jak BSA.
Hamowanie reakcji PCR można wykazać poprzez zastosowanie wewnętrznej kontroli jakości procesu (IPC).
Należy zachować ostrożność w celu usunięcia wszystkich odczynników i innych roztworów w zestawie ekstrakcji, takich jak etanol, EDTA, CETAB, LICL, GUSCN, SDS, izopropanol i fenol, z izolatu kwasu nukleinowego przez dokładny etap mycia. W zależności od ich stężenia mogą aktywować lub hamować PCR.