Czynniki zakłócające reakcje PCR

W trakcie reakcji PCR często napotyka się pewne czynniki zakłócające.
Ze względu na bardzo wysoką czułość metody PCR, zanieczyszczenie jest uważane za jeden z najważniejszych czynników wpływających na wyniki PCR i może powodować fałszywie dodatnie wyniki.
Równie krytyczne są różne źródła, które prowadzą do wyników fałszywie ujemnych. Jeśli jedna lub więcej istotnych części mieszaniny PCR lub sama reakcja amplifikacji są hamowane lub zakłócane, test diagnostyczny może zostać utrudniony. Może to prowadzić do zmniejszonej wydajności, a nawet wyników fałszywie ujemnych.
Oprócz hamowania, utrata integralności docelowego kwasu nukleinowego może wystąpić z powodu warunków transportu i/lub przechowywania przed przygotowaniem próbki. W szczególności wysokie temperatury lub nieodpowiednie przechowywanie mogą prowadzić do uszkodzenia komórek i kwasów nukleinowych. Utrwalanie komórek i tkanek oraz zatapianie w parafinie są dobrze znanymi przyczynami fragmentacji DNA i uporczywym problemem (patrz rysunki 1 i 2). W takich przypadkach nawet optymalna izolacja i oczyszczanie nie pomogą.

Rysunek 1 | Wpływ unieruchomienia na integralność DNA
Elektroforeza w żelu agarozowym wykazała, że ​​jakość DNA wyizolowanego z parafinowych skrawków zwłok różniła się znacznie. W zależności od metody utrwalania w ekstraktach znajdowało się DNA o różnych średnich długościach fragmentów. DNA było zachowane tylko po utrwaleniu w natywnych zamrożonych próbkach i w buforowanej neutralnej formalinie. Zastosowanie silnie kwaśnego utrwalacza Bouina lub niebuforowanej formaliny zawierającej kwas mrówkowy spowodowało znaczną utratę DNA. Pozostała frakcja jest silnie pofragmentowana.
Po lewej stronie długość fragmentów wyrażona jest w kiloparach zasad (kbp)

Rysunek 2 | Utrata integralności docelowych kwasów nukleinowych
(a) Przerwa 3′-5′ na obu niciach spowoduje pęknięcie docelowego DNA. Synteza DNA nadal będzie zachodzić na małym fragmencie. Jednakże, jeśli na fragmencie DNA brakuje miejsca wyżarzania primera, zachodzi tylko amplifikacja liniowa. W najbardziej korzystnym przypadku fragmenty mogą się wzajemnie nasycić, ale wydajność będzie niewielka i poniżej poziomów wykrywania.
(b) Utrata zasad, głównie z powodu depurynacji i tworzenia dimeru tymidynowego, prowadzi do zmniejszenia liczby wiązań wodorowych i zmniejszenia Tm. Podczas wydłużonej fazy nagrzewania primery rozpuszczą się od matrycy DNA i nie ulegną wyżarzeniu nawet w mniej rygorystycznych warunkach.
(c) Sąsiadujące zasady tyminowe tworzą dimer TT.
Innym powszechnym problemem, który często występuje w diagnostyce molekularnej, jest mniej niż optymalne uwalnianie docelowych kwasów nukleinowych w porównaniu z ekstrakcją fenolem i chloroformem. W skrajnych przypadkach może to być związane z fałszywie negatywnymi wynikami. Dużo czasu można zaoszczędzić, stosując lizę wrzącą lub trawienie enzymatyczne resztek komórek, ale ta metoda często skutkuje niską czułością PCR z powodu niewystarczającego uwalniania kwasów nukleinowych.

Hamowanie aktywności polimerazy podczas amplifikacji

Ogólnie rzecz biorąc, hamowanie jest używane jako koncepcja kontenerowa do opisu wszystkich czynników, które prowadzą do suboptymalnych wyników PCR. W ściśle biochemicznym sensie hamowanie jest ograniczone do aktywności enzymu, tj. zmniejsza lub zapobiega konwersji substrat-produkt poprzez interakcję z miejscem aktywnym polimerazy DNA lub jej kofaktorem (np. Mg2+ dla polimerazy DNA Taq).
Składniki próbki lub różnych buforów i ekstraktów zawierających odczynniki mogą bezpośrednio hamować enzym lub wychwytywać jego kofaktory (np. EDTA), powodując w ten sposób inaktywację polimerazy i prowadząc do zaniżonych lub fałszywie ujemnych wyników PCR.
Jednak wiele interakcji między składnikami reakcji a kwasami nukleinowymi zawierającymi cel jest również określanych jako „inhibitory PCR”. Gdy integralność komórki zostanie zakłócona przez izolację, a kwas nukleinowy zostanie uwolniony, mogą wystąpić interakcje między próbką a otaczającym ją roztworem i fazą stałą. Na przykład „zbieracze” mogą wiązać jedno- lub dwuniciowe DNA poprzez oddziaływania niekowalencyjne i zakłócać izolację i oczyszczanie, zmniejszając liczbę celów, które ostatecznie docierają do naczynia reakcyjnego PCR.
Ogólnie rzecz biorąc, inhibitory PCR są obecne w większości płynów ustrojowych i odczynnikach stosowanych w testach diagnostyki klinicznej (mocznik w moczu, hemoglobina i heparyna we krwi), suplementach diety (składniki organiczne, glikogen, tłuszcz, jony Ca2+) i składnikach środowiska (fenole, metale ciężkie).

Bardziej rozpowszechnione inhibitory PCR można znaleźć w bakteriach i komórkach eukariotycznych, DNA niebędącym celem, makrocząsteczkach wiążących DNA macierzy tkankowych i sprzęcie laboratoryjnym, takim jak rękawiczki i tworzywa sztuczne. Oczyszczanie kwasów nukleinowych podczas lub po ekstrakcji jest preferowaną metodą usuwania inhibitorów PCR.
Obecnie różne zautomatyzowane urządzenia do ekstrakcji mogą zastąpić wiele protokołów ręcznych, ale nigdy nie osiągnięto 100% odzysku i/lub oczyszczenia celów. Potencjalne inhibitory mogą być nadal obecne w oczyszczonych kwasach nukleinowych lub mogły już zadziałać. Istnieją różne strategie zmniejszania wpływu inhibitorów. Wybór odpowiedniej polimerazy może mieć znaczący wpływ na aktywność inhibitora. Inne sprawdzone metody zmniejszania hamowania PCR to zwiększanie stężenia polimerazy lub stosowanie dodatków, takich jak BSA.
Zahamowanie reakcji PCR można wykazać stosując wewnętrzną kontrolę jakości procesu (IPC).
Należy zachować ostrożność, aby usunąć wszystkie odczynniki i inne roztwory w zestawie do ekstrakcji, takie jak etanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, izopropanol i fenol, z izolatu kwasu nukleinowego poprzez dokładny etap płukania. W zależności od ich stężenia mogą one aktywować lub hamować PCR.