Czynniki zakłócające w reakcjach PCR

Podczas reakcji PCR często spotyka się pewne czynniki zakłócające.
Ze względu na bardzo wysoką czułość PCR, zanieczyszczenie jest uważane za jeden z najważniejszych czynników wpływających na wyniki PCR i może dawać fałszywie dodatnie wyniki.
Równie istotne są różne źródła, które prowadzą do wyników fałszywie ujemnych. Jeżeli jedna lub więcej istotnych części mieszaniny PCR lub sama reakcja amplifikacji zostanie zahamowana lub zakłócona, test diagnostyczny może być utrudniony. Może to prowadzić do zmniejszenia wydajności, a nawet wyników fałszywie ujemnych.
Oprócz hamowania może wystąpić utrata integralności docelowego kwasu nukleinowego z powodu warunków transportu i/lub przechowywania przed przygotowaniem próbki. W szczególności wysokie temperatury lub niewłaściwe przechowywanie mogą prowadzić do uszkodzenia komórek i kwasów nukleinowych. Utrwalanie komórek i tkanek oraz zatapianie w parafinie to dobrze znane przyczyny fragmentacji DNA i utrzymujący się problem (patrz ryc. 1 i 2). W takich przypadkach nawet optymalna izolacja i oczyszczanie nie pomogą.

Rysunek 1 | Wpływ immobilizacji na integralność DNA
Elektroforeza w żelu agarozowym wykazała, że ​​jakość DNA wyizolowanego ze skrawków parafinowych sekcji zwłok znacznie się różniła. W ekstraktach występowało DNA o różnej średniej długości fragmentów, w zależności od metody utrwalenia. DNA zakonserwowano jedynie po utrwaleniu w natywnych zamrożonych próbkach i w buforowanej obojętnej formalinie. Zastosowanie silnie kwaśnego utrwalacza Bouina lub niebuforowanej formaliny zawierającej kwas mrówkowy spowodowało znaczną utratę DNA. Pozostała frakcja jest silnie rozdrobniona.
Po lewej stronie długość fragmentów wyrażona jest w parach kilozasadowych (kbp)

Rysunek 2 | Utrata integralności docelowych kwasów nukleinowych
(a) Luka 3′-5′ na obu niciach spowoduje pęknięcie docelowego DNA. synteza DNA będzie nadal zachodzić na małym fragmencie. Jeżeli jednak we fragmencie DNA brakuje miejsca przyłączania startera, następuje jedynie amplifikacja liniowa. W najkorzystniejszym przypadku fragmenty mogą się wzajemnie nasycać, ale wydajność będzie niewielka i niższa od poziomu wykrywalności.
(b) Utrata zasad, głównie na skutek depurynacji i tworzenia dimeru tymidyny, prowadzi do zmniejszenia liczby wiązań wodorowych i zmniejszenia Tm. Podczas wydłużonej fazy rozgrzewania startery stopią się z matrycowym DNA i nie połączą się nawet w mniej rygorystycznych warunkach.
(c) Sąsiednie zasady tyminowe tworzą dimer TT.
Innym częstym problemem, który często pojawia się w diagnostyce molekularnej, jest nieoptymalne uwalnianie docelowych kwasów nukleinowych w porównaniu z ekstrakcją fenolowo-chloroformową. W skrajnych przypadkach może to być powiązane z fałszywymi negatywami. Wiele czasu można zaoszczędzić poprzez lizę wrzącą lub enzymatyczne trawienie resztek komórkowych, ale ta metoda często skutkuje niską czułością PCR z powodu niewystarczającego uwalniania kwasu nukleinowego.

Hamowanie aktywności polimerazy podczas amplifikacji

Ogólnie rzecz biorąc, hamowanie jest pojęciem zbiorczym opisującym wszystkie czynniki prowadzące do suboptymalnych wyników PCR. W sensie ściśle biochemicznym hamowanie ogranicza się do aktywności enzymu, tj. zmniejsza lub uniemożliwia konwersję substratu w produkt poprzez interakcję z miejscem aktywnym polimerazy DNA lub jej kofaktorem (np. Mg2+ w przypadku polimerazy DNA Taq).
Składniki próbki lub różne bufory i ekstrakty zawierające odczynniki mogą bezpośrednio hamować enzym lub zatrzymywać jego kofaktory (np. EDTA), inaktywując w ten sposób polimerazę, co z kolei prowadzi do obniżonych lub fałszywie ujemnych wyników PCR.
Jednakże wiele interakcji między składnikami reakcji a kwasami nukleinowymi zawierającymi cel jest również określanych jako „inhibitory PCR”. Gdy integralność komórki zostanie naruszona w wyniku izolacji i uwolniony zostanie kwas nukleinowy, mogą wystąpić interakcje pomiędzy próbką a otaczającym ją roztworem i fazą stałą. Na przykład „zmiatacze” mogą wiązać jedno- lub dwuniciowy DNA poprzez interakcje niekowalencyjne i zakłócać izolację i oczyszczanie poprzez zmniejszenie liczby celów, które ostatecznie docierają do naczynia reakcyjnego PCR.
Ogólnie rzecz biorąc, inhibitory PCR występują w większości płynów ustrojowych i odczynników stosowanych w diagnostyce klinicznej (mocznik w moczu, hemoglobina i heparyna we krwi), suplementach diety (składniki organiczne, glikogen, tłuszcz, jony Ca2+) oraz składnikach środowiska (fenole). , metale ciężkie)

Bardziej rozpowszechnione inhibitory PCR można znaleźć w bakteriach i komórkach eukariotycznych, DNA niebędącym przedmiotem docelowym, makrocząsteczkach wiążących DNA w matrycach tkankowych i sprzęcie laboratoryjnym, takim jak rękawiczki i tworzywa sztuczne. Oczyszczanie kwasów nukleinowych podczas lub po ekstrakcji jest preferowaną metodą usuwania inhibitorów PCR.
Obecnie różne zautomatyzowane urządzenia do ekstrakcji mogą zastąpić wiele ręcznych protokołów, ale nigdy nie osiągnięto 100% odzysku i/lub oczyszczenia obiektów docelowych. Potencjalne inhibitory mogą nadal być obecne w oczyszczonych kwasach nukleinowych lub mogły już zacząć działać. Istnieją różne strategie zmniejszania wpływu inhibitorów. Wybór odpowiedniej polimerazy może mieć istotny wpływ na aktywność inhibitora. Inne sprawdzone metody zmniejszania inhibicji PCR to zwiększanie stężenia polimerazy lub stosowanie dodatków takich jak BSA.
Hamowanie reakcji PCR można wykazać stosując wewnętrzną kontrolę jakości procesu (IPC).
Należy zachować ostrożność, aby usunąć z izolatu kwasu nukleinowego wszystkie odczynniki i inne roztwory, takie jak etanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, izopropanol i fenol, poprzez dokładne przemycie. W zależności od stężenia mogą aktywować lub hamować reakcję PCR.