Testy metylacji DNA w połączeniu ze smartfonami do wczesnego wykrywania nowotworów i białaczek z dokładnością 90,0%!

Wczesne wykrywanie nowotworów w oparciu o biopsję płynną to nowy kierunek wykrywania i diagnostyki nowotworów zaproponowany w ostatnich latach przez amerykański Narodowy Instytut Raka, którego celem jest wykrywanie wczesnego nowotworu, a nawet zmian przednowotworowych. Jest szeroko stosowany jako nowy biomarker do wczesnej diagnostyki różnych nowotworów złośliwych, w tym raka płuc, nowotworów przewodu pokarmowego, glejaków i nowotworów ginekologicznych.

Pojawienie się platform umożliwiających identyfikację biomarkerów krajobrazu metylacji (Methylscape) może znacząco ulepszyć istniejące wczesne badania przesiewowe w kierunku raka, umożliwiając pacjentom najwcześniejszy możliwy do wyleczenia etap.

Niedawno badacze opracowali prostą i bezpośrednią platformę czujnikową do wykrywania krajobrazu metylacji opartą na nanocząsteczkach złota ozdobionych cysteaminą (Cyst/AuNP) w połączeniu z biosensorem opartym na smartfonie, który umożliwia szybkie wczesne badanie przesiewowe szerokiego zakresu nowotworów. Wczesne badania przesiewowe w kierunku białaczki można wykonać w ciągu 15 minut od ekstrakcji DNA z próbki krwi z dokładnością do 90,0%. Tytuł artykułu brzmi: Szybkie wykrywanie nowotworowego DNA w ludzkiej krwi przy użyciu AuNP zabezpieczonych cysteaminą i smartfona obsługującego uczenie maszynowe.

Rysunek 1. Prostą i szybką platformę wykrywania raka do badań przesiewowych w kierunku raka za pomocą komponentów Cyst/AuNP można stworzyć w dwóch prostych krokach.

Pokazano to na rycinie 1. Najpierw do rozpuszczenia fragmentów DNA użyto wodnego roztworu. Następnie do mieszanego roztworu dodano Cyst/AuNP. Normalny i złośliwy DNA mają różne właściwości metylacji, w wyniku czego powstają fragmenty DNA o różnych wzorach samoorganizacji. Normalny DNA agreguje luźno i ostatecznie agreguje Cyst/AuNP, co powoduje przesunięcie ku czerwieni charakteru Cyst/AuNP, tak że gołym okiem można zaobserwować zmianę koloru z czerwonego na fioletowy. Natomiast unikalny profil metylacji nowotworowego DNA prowadzi do wytwarzania większych skupisk fragmentów DNA.

Zdjęcia płytek 96-dołkowych wykonano aparatem w smartfonie. DNA nowotworu mierzono za pomocą smartfona wyposażonego w uczenie maszynowe w porównaniu z metodami opartymi na spektroskopii.

Badania przesiewowe w kierunku raka w prawdziwych próbkach krwi

Aby zwiększyć użyteczność platformy czujnikowej, badacze zastosowali czujnik, który skutecznie rozróżnia normalne i nowotworowe DNA w prawdziwych próbkach krwi. wzorce metylacji w miejscach CpG epigenetycznie regulują ekspresję genów. W prawie wszystkich typach nowotworów zaobserwowano naprzemienne zmiany w metylacji DNA, a tym samym w ekspresji genów promujących powstawanie nowotworów.

Jako model dla innych nowotworów związanych z metylacją DNA badacze wykorzystali próbki krwi od pacjentów z białaczką i od zdrowych osób w grupie kontrolnej, aby zbadać skuteczność krajobrazu metylacji w różnicowaniu nowotworów białaczkowych. Ten biomarker krajobrazu metylacji nie tylko przewyższa istniejące metody szybkiego badania przesiewowego białaczki, ale także wykazuje możliwość rozszerzenia go na wczesne wykrywanie szerokiego zakresu nowotworów przy użyciu tego prostego i jednoznacznego testu.

Przeanalizowano DNA z próbek krwi od 31 pacjentów z białaczką i 12 zdrowych osób. jak pokazano na wykresie pudełkowym na Figurze 2a, względna absorbancja próbek nowotworu (ΔA650/525) była niższa niż DNA z normalnych próbek. było to głównie spowodowane zwiększoną hydrofobowością prowadzącą do gęstej agregacji DNA nowotworu, co zapobiegało agregacji Cyst/AuNP. W rezultacie nanocząstki te zostały całkowicie rozproszone w zewnętrznych warstwach agregatów nowotworowych, co skutkowało odmiennym rozproszeniem cyst/AuNP zaadsorbowanych na agregatach DNA prawidłowego i nowotworowego. Następnie wygenerowano krzywe ROC, zmieniając próg od wartości minimalnej ΔA650/525 do wartości maksymalnej.

Rycina 2.(a) Względne wartości absorbancji roztworów cyst/AuNPs pokazujące obecność normalnego (niebieskiego) i nowotworowego (czerwonego) DNA w zoptymalizowanych warunkach

(DA650/525) działek skrzynkowych; (b) Analiza ROC i ocena testów diagnostycznych. (c) Matryca zamieszania w diagnostyce pacjentów zdrowych i chorych na raka. (d) Czułość, swoistość, dodatnia wartość predykcyjna (PPV), ujemna wartość predykcyjna (NPV) i dokładność opracowanej metody.

Jak pokazano na rycinie 2b, pole pod krzywą ROC (AUC = 0,9274) uzyskane dla opracowanego czujnika wykazało wysoką czułość i swoistość. Jak widać na wykresie pudełkowym, najniższy punkt reprezentujący prawidłową grupę DNA nie jest dobrze oddzielony od najwyższego punktu reprezentującego grupę DNA nowotworu; dlatego też do rozróżnienia pomiędzy grupą osób zdrowych i chorych na raka zastosowano regresję logistyczną. Biorąc pod uwagę zestaw niezależnych zmiennych, szacuje prawdopodobieństwo wystąpienia zdarzenia, takiego jak nowotwór lub grupa normalna. Zmienna zależna mieści się w przedziale od 0 do 1. Wynik jest zatem prawdopodobieństwem. Określiliśmy prawdopodobieństwo identyfikacji nowotworu (P) na podstawie ΔA650/525 w następujący sposób.

gdzie b=5,3533,w1=-6,965. W przypadku klasyfikacji próbki prawdopodobieństwo mniejsze niż 0,5 wskazuje na próbkę prawidłową, natomiast prawdopodobieństwo 0,5 lub wyższe wskazuje próbkę nowotworu. Rysunek 2c przedstawia macierz zamieszania wygenerowaną w wyniku niezależnej walidacji krzyżowej, którą wykorzystano do sprawdzenia stabilności metody klasyfikacji. Rycina 2d podsumowuje ocenę testu diagnostycznego metody, w tym czułość, swoistość, dodatnią wartość predykcyjną (PPV) i ujemną wartość predykcyjną (NPV).

Bioczujniki na smartfony

Aby jeszcze bardziej uprościć badanie próbek bez użycia spektrofotometrów, naukowcy wykorzystali sztuczną inteligencję (AI) do interpretacji koloru roztworu i rozróżnienia między osobnikami zdrowymi i chorymi na nowotwory. W związku z tym wykorzystano wizję komputerową do przełożenia koloru roztworu cyst/AuNP na normalne DNA (fioletowy) lub nowotworowy DNA (czerwony) przy użyciu obrazów 96-dołkowych płytek wykonanych aparatem w telefonie komórkowym. Sztuczna inteligencja może obniżyć koszty i poprawić dostępność w interpretacji koloru roztworów nanocząsteczek i to bez użycia jakichkolwiek optycznych akcesoriów do smartfonów. Na koniec przeszkolono dwa modele uczenia maszynowego, w tym las losowy (RF) i maszynę wektorów nośnych (SVM), w celu skonstruowania modeli. zarówno model RF, jak i SVM prawidłowo klasyfikowały próbki jako dodatnie i ujemne z dokładnością 90,0%. Sugeruje to, że wykorzystanie sztucznej inteligencji w biosensorach wykorzystujących telefony komórkowe jest całkiem możliwe.

Rysunek 3.(a) Klasa docelowa roztworu zarejestrowana podczas przygotowania próbki do etapu akwizycji obrazu. (b) Przykładowe zdjęcie wykonane na etapie pozyskiwania obrazu. ( c ) Intensywność koloru roztworu cysty / AuNP w każdej studzience 96-studzienkowej płytki wyekstrahowanej z obrazu ( b ).

Wykorzystując Cyst/AuNP, badaczom z powodzeniem opracowano prostą platformę czujnikową do wykrywania krajobrazu metylacji oraz czujnik umożliwiający odróżnienie normalnego DNA od DNA nowotworu w przypadku stosowania prawdziwych próbek krwi do badań przesiewowych w kierunku białaczki. Opracowany czujnik wykazał, że DNA pobrany z prawdziwych próbek krwi umożliwia szybkie i niedrogie wykrycie niewielkich ilości DNA nowotworu (3 nM) u pacjentów z białaczką w ciągu 15 minut, a jego dokładność wynosi 95,3%. Aby jeszcze bardziej uprościć badanie próbek poprzez wyeliminowanie konieczności stosowania spektrofotometru, zastosowano uczenie maszynowe do interpretacji koloru roztworu i rozróżnienia osób zdrowych od chorych na raka na podstawie zdjęcia wykonanego telefonem komórkowym. Dokładność również udało się osiągnąć na poziomie 90,0%.

Numer referencyjny: DOI: 10.1039/d2ra05725e