Połączenie testów metylacji DNA ze smartfonami pozwala na wczesne wykrywanie nowotworów i białaczki z dokładnością 90,0%!

Wczesne wykrywanie raka na podstawie biopsji płynnej to nowy kierunek wykrywania i diagnozowania raka zaproponowany przez US National Cancer Institute w ostatnich latach, którego celem jest wykrywanie wczesnych nowotworów lub nawet zmian przednowotworowych. Jest szeroko stosowany jako nowy biomarker do wczesnej diagnostyki różnych nowotworów złośliwych, w tym raka płuc, guzów przewodu pokarmowego, glejaków i guzów ginekologicznych.

Powstanie platform umożliwiających identyfikację biomarkerów metylacji (Methylscape) może znacząco usprawnić istniejące wczesne badania przesiewowe w kierunku raka, umożliwiając pacjentom wykrycie najwcześniejszego możliwego etapu choroby.

Niedawno naukowcy opracowali prostą i bezpośrednią platformę pomiarową do wykrywania krajobrazu metylacji opartą na nanocząsteczkach złota zdobionych cysteaminą (Cyst/AuNP) w połączeniu z biosensorem opartym na smartfonie, który umożliwia szybkie wczesne przesiewowe badanie szerokiego zakresu nowotworów. Wczesne przesiewowe badanie białaczki można wykonać w ciągu 15 minut po ekstrakcji DNA z próbki krwi, z dokładnością 90,0%. Tytuł artykułu to Szybkie wykrywanie DNA raka we krwi ludzkiej przy użyciu AuNP pokrytych cysteaminą i smartfona z włączonym uczeniem maszynowym.

Rysunek 1. Prostą i szybką platformę pomiarową do badań przesiewowych w kierunku raka za pomocą komponentów Cyst/AuNP można zbudować w dwóch prostych krokach.

Pokazano to na rysunku 1. Najpierw użyto wodnego roztworu do rozpuszczenia fragmentów DNA. Następnie do wymieszanego roztworu dodano Cyst/AuNP. Normalne i złośliwe DNA mają różne właściwości metylacji, co skutkuje fragmentami DNA o różnych wzorach samoorganizacji. Normalne DNA agreguje luźno i ostatecznie agreguje Cyst/AuNP, co skutkuje przesunięciem ku czerwieni Cyst/AuNP, tak że zmianę koloru z czerwonego na fioletowy można zaobserwować gołym okiem. Natomiast unikalny profil metylacji DNA nowotworowego prowadzi do produkcji większych skupisk fragmentów DNA.

Zdjęcia płytek 96-dołkowych wykonano za pomocą aparatu w smartfonie. DNA nowotworowe mierzono za pomocą smartfona wyposażonego w uczenie maszynowe w porównaniu z metodami opartymi na spektroskopii.

Badania przesiewowe w kierunku raka w prawdziwych próbkach krwi

Aby rozszerzyć użyteczność platformy pomiarowej, badacze zastosowali czujnik, który skutecznie rozróżniał normalne i rakowe DNA w rzeczywistych próbkach krwi. Wzory metylacji w miejscach CpG epigenetycznie regulują ekspresję genów. W prawie wszystkich typach raka zaobserwowano naprzemienne zmiany w metylacji DNA, a tym samym w ekspresji genów, które promują nowotworzenie.

Jako model dla innych nowotworów związanych z metylacją DNA, badacze wykorzystali próbki krwi od pacjentów z białaczką i zdrowych osób kontrolnych, aby zbadać skuteczność krajobrazu metylacji w różnicowaniu nowotworów białaczkowych. Ten biomarker krajobrazu metylacji nie tylko przewyższa istniejące szybkie metody przesiewowe białaczki, ale także pokazuje wykonalność rozszerzenia na wczesne wykrywanie szerokiego zakresu nowotworów przy użyciu tego prostego i przejrzystego testu.

Analizowano DNA z próbek krwi pobranych od 31 pacjentów z białaczką i 12 zdrowych osób. Jak pokazano na wykresie pudełkowym na rysunku 2a, względna absorbancja próbek nowotworowych (ΔA650/525) była niższa niż w przypadku DNA z próbek zdrowych. Było to spowodowane głównie zwiększoną hydrofobowością prowadzącą do gęstej agregacji DNA nowotworowego, co zapobiegało agregacji Cyst/AuNP. W rezultacie te nanocząsteczki zostały całkowicie rozproszone w zewnętrznych warstwach agregatów nowotworowych, co spowodowało różną dyspersję Cyst/AuNP zaadsorbowanych na agregatach DNA zdrowych i nowotworowych. Następnie wygenerowano krzywe ROC, zmieniając próg od wartości minimalnej ΔA650/525 do wartości maksymalnej.

Rysunek 2.(a) Względne wartości absorbancji roztworów cyst/AuNPs pokazujące obecność prawidłowego (niebieski) i nowotworowego (czerwony) DNA w zoptymalizowanych warunkach

(DA650/525) wykresów pudełkowych; (b) Analiza ROC i ocena testów diagnostycznych. (c) Macierz pomyłek w diagnostyce pacjentów zdrowych i chorych na raka. (d) Czułość, swoistość, wartość predykcyjna dodatnia (PPV), wartość predykcyjna ujemna (NPV) i dokładność opracowanej metody.

Jak pokazano na rysunku 2b, obszar pod krzywą ROC (AUC = 0,9274) uzyskany dla opracowanego czujnika wykazał wysoką czułość i swoistość. Jak widać na wykresie pudełkowym, najniższy punkt reprezentujący grupę normalnego DNA nie jest dobrze oddzielony od najwyższego punktu reprezentującego grupę DNA nowotworowego; dlatego do rozróżnienia grup normalnych i nowotworowych zastosowano regresję logistyczną. Biorąc pod uwagę zbiór zmiennych niezależnych, szacuje ona prawdopodobieństwo wystąpienia zdarzenia, takiego jak grupa nowotworowa lub normalna. Zmienna zależna mieści się w zakresie od 0 do 1. Wynik jest zatem prawdopodobieństwem. Prawdopodobieństwo identyfikacji raka (P) określiliśmy na podstawie ΔA650/525 w następujący sposób.

gdzie b=5,3533,w1=-6,965. W przypadku klasyfikacji próbek prawdopodobieństwo mniejsze niż 0,5 wskazuje na próbkę normalną, podczas gdy prawdopodobieństwo 0,5 lub wyższe wskazuje na próbkę nowotworową. Rysunek 2c przedstawia macierz pomyłek wygenerowaną z walidacji krzyżowej typu leave-it-alone, która została użyta do walidacji stabilności metody klasyfikacji. Rysunek 2d podsumowuje ocenę testu diagnostycznego metody, w tym czułość, swoistość, dodatnią wartość predykcyjną (PPV) i ujemną wartość predykcyjną (NPV).

Biosensory oparte na smartfonach

Aby jeszcze bardziej uprościć testowanie próbek bez użycia spektrofotometrów, naukowcy wykorzystali sztuczną inteligencję (AI) do interpretacji koloru roztworu i rozróżnienia osób zdrowych od chorych na raka. Biorąc to pod uwagę, komputerowa wizja została użyta do przetłumaczenia koloru roztworu Cyst/AuNPs na normalne DNA (fioletowe) lub nowotworowe DNA (czerwone) przy użyciu obrazów 96-dołkowych płytek wykonanych za pomocą aparatu telefonu komórkowego. Sztuczna inteligencja może obniżyć koszty i poprawić dostępność w interpretacji koloru roztworów nanocząstek, bez użycia jakichkolwiek optycznych akcesoriów sprzętowych do smartfonów. Na koniec wytrenowano dwa modele uczenia maszynowego, w tym Random Forest (RF) i Support Vector Machine (SVM), aby zbudować modele. Zarówno model RF, jak i SVM prawidłowo klasyfikowały próbki jako pozytywne i negatywne z dokładnością 90,0%. Sugeruje to, że wykorzystanie sztucznej inteligencji w bioczujnikach opartych na telefonach komórkowych jest całkiem możliwe.

Rysunek 3.(a) Klasa docelowa roztworu zarejestrowana podczas przygotowywania próbki do etapu akwizycji obrazu. (b) Przykładowy obraz wykonany podczas etapu akwizycji obrazu. (c) Intensywność koloru roztworu cyst/AuNP w każdym dołku płytki 96-dołkowej wyodrębnionej z obrazu (b).

Wykorzystując Cyst/AuNP, naukowcy pomyślnie opracowali prostą platformę czujnikową do wykrywania krajobrazu metylacji i czujnik zdolny do odróżniania normalnego DNA od DNA nowotworowego przy użyciu prawdziwych próbek krwi do badań przesiewowych w kierunku białaczki. Opracowany czujnik wykazał, że DNA wyekstrahowane z prawdziwych próbek krwi było w stanie szybko i ekonomicznie wykryć niewielkie ilości DNA nowotworowego (3 nM) u pacjentów z białaczką w ciągu 15 minut i wykazał dokładność 95,3%. Aby jeszcze bardziej uprościć testowanie próbek poprzez wyeliminowanie potrzeby stosowania spektrofotometru, zastosowano uczenie maszynowe do interpretacji koloru roztworu i odróżnienia osób zdrowych od nowotworowych przy użyciu zdjęcia wykonanego telefonem komórkowym, a dokładność udało się również osiągnąć na poziomie 90,0%.

Odniesienie: DOI: 10.1039/d2ra05725e